基因重組—層析法
實驗方法原理
攜帶有目標(biāo)蛋白基因的質(zhì)粒在大腸桿菌BL21中，在 37℃，IPTG誘導(dǎo)下，超量表達(dá)攜帶有6個連續(xù)組氨酸殘基的重組氯霉素?；D(zhuǎn)移酶蛋白，該蛋白可用一種通過共價偶連的次氨基三乙酸（NTA）使鎳離子（Ni2+）固相化的層析介質(zhì)加以提純，實為金屬熬合親和層析（MCAC）。蛋白質(zhì)的純化程度可通過聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分析。

實驗材料
大腸桿菌BL21
試劑、試劑盒
LB液體培養(yǎng)基 氨芐青霉素 Washing Buffer Elution Buffer IPTG 蒸餾水 胰蛋白胨 酵母粉 氯化鈉
儀器、耗材
搖床 離心機(jī) 層析柱 離心管 移液槍 槍頭盒 燒杯 玻璃棒

實驗步驟
一、試劑準(zhǔn)備
1.  LB液體培養(yǎng)基：Trytone 10 g， yeast extract 5 g，NaCl 10 g，用蒸餾水配至1000 mL。
2.  氨芐青霉素：100 mg/mL。
3.  上樣緩沖液：100 mM NaH2PO4，10 mM Tris，8M Urea，10 mM  2-ME，pH8.0。
4.  Washing Buffer：100 mM NaH2PO4，10 mM Tris，8 M Urea，pH6.3。
5.   Elution Buffer：100 mM NaH2PO4，10 mMTris，8M Urea， 500 mM Imidazole， pH8.0。
6.   IPTG：100mM IPTG（異丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于100ml ddH2O中,0.22 um濾膜抽濾，-20℃保存。

二、獲得目的基因
1.  通過PCR方法：以含目的基因的克隆質(zhì)粒為模板，按基因序列設(shè)計一對引物（在上游和下游引物分別引入不同的酶切位點），PCR循環(huán)獲得所需基因片段。
2.  通過RT-PCR方法：用TRIzol法從細(xì)胞或組織中提取總RNA，以mRNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA第一鏈，以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR循環(huán)獲得產(chǎn)物。

三、構(gòu)建重組表達(dá)載體
1.  載體酶切：將表達(dá)質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶（同引物的酶切位點）進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物行瓊脂糖電泳后，用膠回收Kit或凍融法回收載體大片段。
2.  PCR產(chǎn)物雙酶切后回收，在T4DNA連接酶作用下連接入載體。

四、獲得含重組表達(dá)質(zhì)粒的表達(dá)菌種
1.  將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，根據(jù)重組載體的標(biāo)志（抗Amp或藍(lán)白斑）作篩選，挑取單斑，堿裂解法小量抽提質(zhì)粒，雙酶切初步鑒定。
2.  測序驗證目的基因的插入方向及閱讀框架均正確,進(jìn)入下步操作。否則應(yīng)篩選更多克隆，重復(fù)亞克隆或亞克隆至不同酶切位點。
3.  以此重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌的感受態(tài)細(xì)胞。

五、氯霉素酰基轉(zhuǎn)移酶重組蛋白的誘導(dǎo)
1.   接種含有重組氯霉素?；D(zhuǎn)移酶蛋白的大腸桿菌BL21菌株于5 mL LB液體培養(yǎng)基中（含100 ug/mL 氨芐青霉素），37℃震蕩培養(yǎng)過夜。
2.  按1∶50或1：100的比例稀釋過夜菌，一般轉(zhuǎn)接1 mL過夜培養(yǎng)物于100 mL（含100 ug/mL 氨芐青霉素）LB液體培養(yǎng)基中，37℃震蕩培養(yǎng)至OD600 = 0.6 - 0.8（最好0.6，大約需3 h）。取10 ul 樣品用于SDS-PAGE 分析。
3.   對照組不加誘導(dǎo)劑，實驗組加入IPTG至終濃度0.5 mmol/l，37℃繼續(xù)培養(yǎng)1-3h。
4.  12 000 rpm 離心10 min，棄上清，菌體沉淀保存于-20℃或-70℃冰箱中。

六、氯霉素?；D(zhuǎn)移酶重組蛋白的分離、純化
1.  NTA層析柱的準(zhǔn)備：在層析柱中加入1 mL NTA介質(zhì)，并分別用8 mL 去離子水，8 mL上樣緩沖液洗滌。
2.  重組蛋白的變性裂解：在冰浴中凍融菌體沉淀，加入5 mL上樣緩沖液， 用吸管抽吸重懸，超聲波破裂菌體，用振蕩器等輕柔的混勻樣品60 min，4℃ 12000 rpm 離心 30 min，將上清吸至一個干凈的容器中，并棄沉淀。取10 ul 上清樣品用于SDS-PAGE 分析。
3.  上清樣品以10-15 mL/h 流速上Ni2+-NTA柱，收集流出液，取10 ul樣品用于SDS-PAGE 分析。
4.  洗脫雜蛋白：用Washing Buffer以10-15 mL/h流速洗柱，直至OD280 = 0.01分步收集洗脫液，約3-4 h，取10 ul洗脫開始時的樣品用于SDS-PAGE 分析。
5.  洗脫目標(biāo)蛋白：用Elution Buffer洗柱，收集每1 mL 級分，分別取10 ul樣品用于SDS-PAGE 分析。
      
注意事項
1.  選擇表達(dá)載體時，要根據(jù)所表達(dá)蛋白的最終應(yīng)用考慮。如為方便純化，可選擇融合表達(dá)；如為獲得天然蛋白，可選擇非融合表達(dá)。
2.  融合表達(dá)時在選擇外源DNA同載體分子連接反應(yīng)時，對轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯過程中密碼結(jié)構(gòu)的閱讀不能發(fā)生干擾。
3.  菌液OD值要小于1，否則細(xì)胞太濃太老，不易破碎，且質(zhì)粒易丟失。
4.  誘導(dǎo)時間最好做一個梯度，不同蛋白誘導(dǎo)時間需摸索。
5.  誘導(dǎo)溫度適當(dāng)摸索：25、30℃。
6.  IPTG濃度：一般在1 mM 以內(nèi)，可適當(dāng)摸索。
7.  超聲條件可視實際情況改變，只要使菌體裂解充分即可，即菌液清亮不粘稠。

其他
一、原核表達(dá)
1.  原核表達(dá)簡介
將克隆化基因插入合適載體后導(dǎo)入大腸桿菌用于表達(dá)大量蛋白質(zhì)的方法一般稱為原核表達(dá)。這種方法在蛋白純化、定位及功能分析等方面都有應(yīng)用。

2.  大腸桿菌用于表達(dá)重組蛋白的特點
（1）易于生長和控制；
（2）用于細(xì)菌培養(yǎng)的材料不及哺乳動物細(xì)胞系統(tǒng)的材料昂貴；
（3）有各種各樣的大腸桿菌菌株及與之匹配的具各種特性的質(zhì)?？晒┻x擇；
（4）在大腸桿菌中表達(dá)的蛋白由于缺少修飾和糖基化、磷酸化等翻譯后加工，常形成包涵體而影響表達(dá)蛋白的生物學(xué)活性及構(gòu)象。

3.  原核表達(dá)載體
通常為質(zhì)粒，典型的表達(dá)載體應(yīng)具有以下幾種元件：
（1）選擇標(biāo)志的編碼序列；
（2）可控轉(zhuǎn)錄的啟動子；
（3）轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列(轉(zhuǎn)錄終止子，核糖體結(jié)合位點)；
（4）一個多限制酶切位點接頭；
（5）宿主體內(nèi)自主復(fù)制的序列。

4.  原核表達(dá)一般程序
獲得目的基因－準(zhǔn)備表達(dá)載體－將目的基因插入表達(dá)載體中（測序驗證）－轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌－誘導(dǎo)靶蛋白的表達(dá)－表達(dá)蛋白的分析－擴(kuò)增、純化、進(jìn)一步檢測。