大腸桿菌O157:H7是腸出血性大腸桿菌中的代表種類，多次爆發(fā)，造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失，因此，該菌在食品安全等方面具有重要的研究意義。本文締一生物為您介紹常規(guī)培養(yǎng)法檢測(cè)大腸埃希氏菌O157：H7/NM操作步驟如下：

1增菌

以無(wú)菌操作取檢樣25g(或25mL)加入到含有225mL mEC+新生霉素肉湯的均質(zhì)袋中，在拍擊式均質(zhì)器上連續(xù)均質(zhì)1min~2min;或放入盛有225mL mEC+新生霉素肉湯的均質(zhì)杯中，8000r/min~10000r/min均質(zhì)1min~2min。36℃±1℃培養(yǎng)18h~24h。

2分離

取增菌后的mEC+新生霉素肉湯，劃線接種于CT-SMAC平板和大腸埃希氏菌O157顯色瓊脂平板上，36℃±1℃培養(yǎng)18h~24h，觀察菌落形態(tài)。在CT-SMAC平板上，典型菌落為圓形、光滑、較小的無(wú)色菌落，中心呈現(xiàn)較暗的灰褐色;在大腸埃希氏菌O157顯色瓊脂平板上的菌落特征按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行判定。

締一生物為您推薦一款CT-SMAC平板，國(guó)際上HiMedia公司生產(chǎn)的，大腸桿菌O157：H7顯色培養(yǎng)基（貨號(hào)：M1340），又名為麥康凱山梨醇培養(yǎng)基，是用于從食物和動(dòng)物飼料中選擇性分離大腸桿菌O157:H7。培養(yǎng)基中含有山梨醇。大腸菌群如肺鹽克雷伯菌發(fā)酵山梨醇，產(chǎn)生粉紅色菌落，大腸桿菌O157:H7不發(fā)酵山梨醇，為無(wú)色菌落。普通大腸桿菌則被鑒別為藍(lán)綠色，大多數(shù)革蘭氏陽(yáng)性菌被結(jié)晶紫和膽鹽抑制。

本品還有化學(xué)限定培養(yǎng)基可選，有效避免患瘋牛病的風(fēng)險(xiǎn)。符合國(guó)標(biāo)GB4789.36—2016大腸埃希氏菌O157:H7/NM檢驗(yàn)CT-SMAC平板試劑規(guī)定。HiMedia公司生產(chǎn)的培養(yǎng)基生產(chǎn)均通過(guò)了ISO9001、ISO13485、WHO-GMP認(rèn)證和CE認(rèn)證，產(chǎn)品質(zhì)量有保障。

3初步生化試驗(yàn)

在CT-SMAC和大腸埃希氏菌O157顯色瓊脂平板上分別挑取5個(gè)~10個(gè)可疑菌落，分別接種TSI瓊脂，同時(shí)接種MUG-LST肉湯，并用大腸埃希氏菌株(ATCC25922或等效標(biāo)準(zhǔn)菌株)做陽(yáng)性對(duì)照和大腸埃希氏菌O157:H7(NCTC12900或等效標(biāo)準(zhǔn)菌株)做陰性對(duì)照，于36℃±1℃培養(yǎng)18h~24h。必要時(shí)進(jìn)行氧化酶試驗(yàn)和革蘭氏染色。

在TSI瓊脂中，典型菌株為斜面與底層均呈黃色，產(chǎn)氣或不產(chǎn)氣，不產(chǎn)生硫化氫(H2S)。置MUG-LST肉湯管于長(zhǎng)波紫外燈下觀察，MUG陽(yáng)性的大腸埃希氏菌株應(yīng)有熒光產(chǎn)生，MUG陰性的應(yīng)無(wú)熒光產(chǎn)生，大腸埃希氏菌O157:H7/NM為MUG試驗(yàn)陰性，無(wú)熒光。挑取可疑菌落，在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上分純，于36℃±1℃培養(yǎng)18h~24h，并進(jìn)行下列鑒定。

4鑒定

4.1血清學(xué)試驗(yàn)

在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上挑取分純的菌落，用O157和H7診斷血清或O157乳膠凝集試劑作玻片凝集試驗(yàn)。對(duì)于H7因子血清不凝集者，應(yīng)穿刺接種半固體瓊脂，檢查動(dòng)力，經(jīng)連續(xù)傳代3次，動(dòng)力試驗(yàn)均陰性，確定為無(wú)動(dòng)力株。如使用不同公司生產(chǎn)的診斷血清或乳膠凝集試劑，應(yīng)按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

4.2生化試驗(yàn)

4.2.1自營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上挑取菌落，進(jìn)行生化試驗(yàn)。大腸埃希氏菌O157:H7/NM生化反應(yīng)特征見(jiàn)表1。

4.2.2如選擇生化鑒定試劑盒或微生物鑒定系統(tǒng)，應(yīng)從營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上挑取菌落，用稀釋液制備成濁度適當(dāng)?shù)木鷳乙海褂蒙b定試劑盒或微生物鑒定系統(tǒng)進(jìn)行鑒定。

4.3毒力基因測(cè)定(可選項(xiàng)目)

樣品中檢出大腸埃希氏菌O157:H7或O157:NM時(shí)，如需要進(jìn)一步檢測(cè)Vero細(xì)胞毒素基因的存在，可通過(guò)接種Vero細(xì)胞或HeLa細(xì)胞，觀察細(xì)胞病變進(jìn)行判定;也可使用基因探針檢測(cè)或聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法進(jìn)行志賀毒素基因(stx1、stx2)、eae、hly等基因的檢測(cè)。如使用試劑盒檢測(cè)上述基因，應(yīng)按照產(chǎn)品的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

HiMedia公司檢測(cè)大腸埃希氏菌O157：H7/NM可用產(chǎn)品：

4.3毒力基因測(cè)定(可選項(xiàng)目)

樣品中檢出大腸埃希氏菌O157:H7或O157:NM時(shí)，如需要進(jìn)一步檢測(cè)Vero細(xì)胞毒素基因的存在，可通過(guò)接種Vero細(xì)胞或HeLa細(xì)胞，觀察細(xì)胞病變進(jìn)行判定;也可使用基因探針檢測(cè)或聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法進(jìn)行志賀毒素基因(stx1、stx2)、eae、hly等基因的檢測(cè)。如使用試劑盒檢測(cè)上述基因，應(yīng)按照產(chǎn)品的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行