急性髓系白血病（AML）是一種侵襲性惡性腫瘤，預(yù)后一般較差，5 年生存率約為 27%。因此，有必要探索 AML 的其他治療方案，以提高生存率并改善總體預(yù)后。

腫瘤免疫監(jiān)視是免疫系統(tǒng)根據(jù)腫瘤特異性抗原在其表面的表達(dá)來識別和消除腫瘤細(xì)胞的一種方式。巨噬細(xì)胞是參與腫瘤消除的主要細(xì)胞，在調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用。此外，巨噬細(xì)胞通過產(chǎn)生細(xì)胞因子和吞噬作用介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞消除。AML可以通過上調(diào) CD47 來逃避巨噬細(xì)胞的吞噬作用。

巨噬細(xì)胞的吞噬活性可以通過抑制 CD47 或激活鈣網(wǎng)蛋白（CRT）來調(diào)節(jié)。CD47 是一種跨膜糖蛋白，起抑制信號的作用，通過與巨噬細(xì)胞表面的信號調(diào)節(jié)蛋白α（SIRPα）結(jié)合來抑制吞噬作用。許多研究報告稱，在包括 AML 在內(nèi)的多種癌細(xì)胞中阻斷 CD47 表達(dá)會導(dǎo)致巨噬細(xì)胞吞噬腫瘤細(xì)胞。CD47 的阻斷可能導(dǎo)致CRT 水平升高，這是巨噬細(xì)胞識別所必需的，因此會觸發(fā) CRT 介導(dǎo)的吞噬作用。

越來越多的證據(jù)表明，由脂多糖（LPS）和其他促炎細(xì)胞因子（如 IFN-γ）激活的 M1 巨噬細(xì)胞可殺死腫瘤細(xì)胞，抑制血管生成，并通過巨噬細(xì)胞消除癌細(xì)胞來改善預(yù)后。許多研究報告了使用體外誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞模型消除癌細(xì)胞。然而，與這種誘導(dǎo)相關(guān)的重要免疫參數(shù)，特別是在 AML 中，仍未*闡明。

基于此，加拿大國家研究委員會計量研究中心、多倫多大學(xué)化學(xué)工程系、西奈山醫(yī)學(xué)院病理學(xué)和檢驗醫(yī)學(xué)系的聯(lián)合團(tuán)隊使用人類巨噬細(xì)胞和癌細(xì)胞共培養(yǎng)證明了一種同時抑制 CD47 和提高 CRT 表達(dá)水平以消除 AML 的新模型，并使用不同濃度（0–100 ng/mL）的 LPS評估了幾個免疫反應(yīng)參數(shù)和相關(guān)的生物標(biāo)志物表達(dá)。該研究結(jié)果為篩選抗AML藥物提供了一種新的共培養(yǎng)方法。

共培養(yǎng)時在 HL-60 白血病細(xì)胞上同時下調(diào) CD47 和增加 CRT 表達(dá)

在這項研究中，假設(shè)白血病細(xì)胞中 CD47 表達(dá)的下調(diào)可以增加共培養(yǎng)中巨噬細(xì)胞對它們的消除。為了驗證這一假設(shè)，人類 HL-60 細(xì)胞（人早幼粒急性白血病細(xì)胞）首先與 THP-1 巨噬細(xì)胞在配對室中共培養(yǎng)（圖1 a  ），將 0、5、20 和 100 ng/mL 的 LPS 添加到含有 THP-1 巨噬細(xì)胞的底部室中，并孵育 16-18 小時，然后評估共培養(yǎng)后 HL-60 上的 CD47 和 CRT 水平。

如圖1 b 所示，HL-60 上的 CD47 水平隨著用于刺激 THP-1 巨噬細(xì)胞的 LPS 量（ng/mL）的增加而降低（圖1 b）。令人驚訝的是，HL-60 上的 CRT 水平也隨著 LPS 劑量的增加而增加（圖1 c）。THP-1 巨噬細(xì)胞的刺激導(dǎo)致CD47 的下調(diào)，有趣的是它增加了 HL-60 細(xì)胞表面的CRT 水平。CD47 水平在 0 ng/mL LPS 時最高，CRT 水平在 0 ng/mL LPS 時效果相反 （圖1 b、c）。在用于刺激與 HL-60 細(xì)胞共培養(yǎng)的 THP-1 巨噬細(xì)胞的所有 LPS 濃度下都可以看到這種模式（圖1 b、c）。CD47 水平在 100 ng/mL LPS 下顯示 81% 的下調(diào)，在 5-20 ng/mL LPS 下顯示 32-77% 的下調(diào)（圖1 b）。

其次，檢查 CD47 的下調(diào)是否發(fā)生在正常血細(xì)胞中。PBMC （外周血單個核細(xì)胞）正常血細(xì)胞在與 HL-60 相同的條件下與分化的 THP-1 巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)并用作對照（圖1 b）。PBMC 在所有使用的 LPS 濃度（包括 0 ng/mL）下表現(xiàn)出相似的低 CD47 表達(dá)水平（圖1 d）。CRT 水平觀察到類似的結(jié)果（圖1 e）。在LPS刺激后與THP-1巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)和單獨培養(yǎng)時，在任何濃度的LPS作用下PBMC正常細(xì)胞中均未見CD47下調(diào)或CRT升高（圖1 d、e）。這些結(jié)果表明，巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞的激活和隨后 CD47 的抑制和 CRT 水平的增加可能僅對癌細(xì)胞具有選擇性，并且可以在不同濃度的激活材料下逐漸應(yīng)用。此外，CD47 的抑制和 CRT 水平的誘導(dǎo)只能在共培養(yǎng)中獲得，表明該模型具有指導(dǎo)白血病治療發(fā)展的潛力。

圖1   與受刺激的 THP-1 巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)后，HL-60 和 PBMC 中的 CD47 和 CRT 水平。

（a）THP-1 巨噬細(xì)胞與 HL60 或 PBMC 在共培養(yǎng)室中共培養(yǎng)的方案。流式細(xì)胞儀分析 HL-60 細(xì)胞中的 CD47（b）和 CRT（c）；與 THP-1 巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)后，PBMC 細(xì)胞中的CD47（d）和 CRT（e）.

共培養(yǎng)中激活 THP-1 巨噬細(xì)胞對 HL-60 的消除和細(xì)胞活力

在共培養(yǎng)中，LPS 用于激活 THP-1 巨噬細(xì)胞，并與 HL-60 白血病細(xì)胞一起孵育過夜。因此，有必要在共培養(yǎng)前研究 LPS 對 HL-60 和 PBMC 活力的影響。此外，為了進(jìn)一步檢驗之前的假設(shè)并研究巨噬細(xì)胞對癌細(xì)胞的消除，測定了與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)后 HL-60 和 PBMC（作為對照）的細(xì)胞凋亡率。

結(jié)果表明，當(dāng)這兩種細(xì)胞系單獨培養(yǎng)并用 LPS 處理時，HL-60 和 PBMC 的活力在所有 LPS 濃度下在 16-18 小時的孵育期間保持在 90% 以上。然而，在與 THP-1 巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)后，隨著 LPS 濃度的增加，觀察到細(xì)胞凋亡增加（圖2 a、c）。HL-60 細(xì)胞的凋亡從 5 ng/mL LPS 時的 22% 增加到 100 ng/mL LPS 時的 77%（圖2 a、c）。然而，與 0 ng/mL LPS 相比，PBMC 在任何 LPS 濃度下都沒有顯示出任何顯著的細(xì)胞凋亡增加（圖 2 b、c）。上述結(jié)果表明，由于 LPS 激活，巨噬細(xì)胞對癌細(xì)胞的消除具有選擇性，并且共培養(yǎng)模型是這種癌細(xì)胞消除發(fā)生所必需的。

圖2   LPS 激活的 THP-1 巨噬細(xì)胞在共培養(yǎng)中消除 HL-60。

HL-60（a）和 PBMC（b）的側(cè)散點圖。所有圖均顯示在 0、5、20 和 100 ng/mL LPS 時發(fā)生的細(xì)胞凋亡。（c）顯示與 THP-1 巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)后癌細(xì)胞和正常細(xì)胞凋亡的百分比。

共培養(yǎng)中 LPS 激活的 THP-1 巨噬細(xì)胞上 CRT 和 CD14 水平升高

實驗進(jìn)一步研究了 LPS 激活的巨噬細(xì)胞上 CRT 和 CD14 的水平及其與吞噬作用的聯(lián)系。實驗注意到，癌細(xì)胞上生物標(biāo)志物表達(dá)的改變只發(fā)生在與巨噬細(xì)胞的共培養(yǎng)中（圖3）。這可能是它們通過 CRT 介導(dǎo)的吞噬作用消除的原因。當(dāng)與 HL-60 和 THP-1 癌細(xì)胞共培養(yǎng)時，THP-1 巨噬細(xì)胞顯示出高水平的 CRT（圖3 a-c、k）。當(dāng) THP-1 巨噬細(xì)胞與 NB4（急性早幼粒白血病細(xì)胞）共培養(yǎng)時，CRT 水平相似，而與 PBMC 共培養(yǎng)時，CRT 水平較低（圖3 d、e、k）。這里需要注意的是，THP-1 巨噬細(xì)胞（與癌細(xì)胞共培養(yǎng)時）上的 CRT 水平顯著高于?與 PBMC 正常細(xì)胞共培養(yǎng)后獲得的 CRT 水平（圖3 k），表明在共培養(yǎng)中 THP-1 巨噬細(xì)胞發(fā)生了更高水平的 CRT 改變，最終導(dǎo)致與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)時發(fā)生吞噬作用和消除癌細(xì)胞。

已知 CD14 參與 LPS 的結(jié)合和隨后產(chǎn)生的促炎反應(yīng)。在實驗結(jié)果中，當(dāng)與 HL-60 和 NB4 共培養(yǎng)時，LPS 激活的 THP-1 巨噬細(xì)胞確實顯示出高水平的 CD14（圖3 f-h、l）。在與 PBMC 正常細(xì)胞共培養(yǎng)后，THP-1 巨噬細(xì)胞上其表達(dá)水平較低（圖3 j、l）。上述所有癌細(xì)胞均單獨培養(yǎng)并用 0、5、20 和 100 ng/mL 的 LPS 處理，之后通過流式細(xì)胞術(shù)測量其表面的 CD14。在 5 ng/mL LPS 處理后，HL60 和 NB4 癌細(xì)胞上的 CD14 水平?jīng)]有顯著增加。對于 THP-1 癌細(xì)胞和 PBMC 正常細(xì)胞，CD14 在所有濃度下的增加均不顯著。在 20 和 100 ng/mL LPS 處理時，HL60 和 NB4 上 CD14 水平顯著增加，然而，當(dāng)與 THP-1 巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)時，所有細(xì)胞系細(xì)胞上的 CD14 水平顯著升高（與單獨培養(yǎng)的水平相比，圖3）。類似地，單獨培養(yǎng)時 THP-1 巨噬細(xì)胞上的 CD14 水平隨著 LPS 濃度的增加而增加，但這些增加的水平遠(yuǎn)低于THP-1 巨噬細(xì)胞與癌細(xì)胞共培養(yǎng)后增加的 CD14 水平（圖3 l）。這些證據(jù)表明，CRT 介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞消除癌細(xì)胞可能發(fā)生在共培養(yǎng)中。

圖3   與白血病細(xì)胞共培養(yǎng)后，THP-1 巨噬細(xì)胞上 CRT 和 CD14 水平升高。

側(cè)散點圖的代表性示例顯示，在與 HL-60 共培養(yǎng)，當(dāng)用 0、5、20 和 100 ng/mL 的 LPS 激活時，THP-1 巨噬細(xì)胞上的 CRT（a）和 CD14（f）水平增加。流式細(xì)胞儀直方圖顯示當(dāng)用 0、5、20 和 100 ng/mL 的 LPS 激活，與 HL-60（b、g）；THP-1癌細(xì)胞（c、i）；NB4（d、h）和PBMC正常細(xì)胞（e、j）共培養(yǎng)時，THP-1巨噬細(xì)胞上的CRT（b-e）和CD14（g-j）水平。與 HL-60、NB4、THP-1 癌細(xì)胞和 PBMC 正常細(xì)胞共培養(yǎng)后 THP-1 巨噬細(xì)胞上CRT（k）和 CD14（l）的水平。

LPS 激活 THP-1 巨噬細(xì)胞后 M1 巨噬細(xì)胞極化相關(guān)細(xì)胞因子水平升高

據(jù)報道，各種 CD47 抑制方法（包括使用 LPS 激活巨噬細(xì)胞）會導(dǎo)致某些細(xì)胞因子的產(chǎn)生增加并刺激吞噬作用。在該研究中，不同濃度的LPS 用于刺激 THP-1 巨噬細(xì)胞。結(jié)果，CD47 在所有使用的白血病細(xì)胞系中都被下調(diào)。實驗還發(fā)現(xiàn)，與對照相比，LPS 刺激以劑量依賴性方式導(dǎo)致 IL-12p70、IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-10 和 IL-8 的顯著產(chǎn)生（圖4）。當(dāng) THP-1 巨噬細(xì)胞在 100 ng/mL LPS 下被激活時，IL-12p70 比對照（0 ng/mL LPS）高 30 倍（圖4 a）。在與對照相同的 LPS 濃度下，IL-6 和 TNF-α 隨后增加超過 20 倍（圖4）。上述所有細(xì)胞因子都是由 M1 型巨噬細(xì)胞分泌的，主要是 LPS 刺激的結(jié)果。共培養(yǎng)培養(yǎng)基上清液中這些細(xì)胞因子的高水平存在表明THP-1巨噬細(xì)胞為M1型，其主要作用是消除癌細(xì)胞。這些結(jié)果是支持實驗假設(shè)的另一個證據(jù)，即在 LPS 刺激共培養(yǎng)中的巨噬細(xì)胞時，CD47 和 CRT 水平發(fā)生變化以標(biāo)記癌細(xì)胞被 M1 巨噬細(xì)胞消除。這在之前的CD47和CRT水平的改變以及癌細(xì)胞的消除（細(xì)胞凋亡）中得到了證明。

圖4   LPS 激活 THP-1 巨噬細(xì)胞后 M1 巨噬細(xì)胞極化標(biāo)志物水平升高。

（a）在 0、5、20 和 100 ng/mL LPS 激活后，相對于 THP-1 巨噬細(xì)胞對照（0 ng/mL LPS）產(chǎn)生的細(xì)胞因子水平（pg/mL）。

（b）THP-1 巨噬細(xì)胞中細(xì)胞因子水平相對于對照的倍數(shù)變化。

圖5 圖形概要

總之，該研究結(jié)果表明，在共培養(yǎng)中成功使用人類巨噬細(xì)胞模型在 AML 癌細(xì)胞中抑制 CD47 并上調(diào) CRT 從而增加它們的消除。此外，數(shù)據(jù)表明該模型對 AML 細(xì)胞具有選擇性，并且不影響其他幾種類型的正常血細(xì)胞，這表明該模型在篩選抗 AML 新藥方面的潛力，以及未來在 AML 治療中使用人類巨噬細(xì)胞的可能性。

參考文獻(xiàn)：Hassan EM, Walker GC, Wang C, Zou S. Anti-leukemia effect associated with down-regulated CD47 and up-regulated calreticulin by stimulated macrophages in co-culture. Cancer Immunol Immunother. 2021 Mar;70(3):787-801. doi: 10.1007/s00262-020-02728-z. Epub 2020 Sep 29. PMID: 32995942.

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