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抗白血病作用與共培養(yǎng)中受刺激的巨噬細(xì)胞下調(diào)CD47和上調(diào)CRT 相關(guān)

來源:上海泉眾機(jī)電科技有限公司   2022年07月19日 13:32  


急性髓系白血?。?/span>AML)是一種侵襲性惡性腫瘤,預(yù)后一般較差,5 年生存率約為 27%。因此,有必要探索 AML 的其他治療方案,以提高生存率并改善總體預(yù)后。


腫瘤免疫監(jiān)視是免疫系統(tǒng)根據(jù)腫瘤特異性抗原在其表面的表達(dá)來識(shí)別和消除腫瘤細(xì)胞的一種方式。巨噬細(xì)胞是參與腫瘤消除的主要細(xì)胞,在調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。此外,巨噬細(xì)胞通過產(chǎn)生細(xì)胞因子和吞噬作用介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞消除。AML可以通過上調(diào) CD47 來逃避巨噬細(xì)胞的吞噬作用。


巨噬細(xì)胞的吞噬活性可以通過抑制 CD47 或激活鈣網(wǎng)蛋白(CRT)來調(diào)節(jié)。CD47 是一種跨膜糖蛋白,起抑制信號(hào)的作用,通過與巨噬細(xì)胞表面的信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白αSIRPα)結(jié)合來抑制吞噬作用。許多研究報(bào)告稱,在包括 AML 在內(nèi)的多種癌細(xì)胞中阻斷 CD47 表達(dá)會(huì)導(dǎo)致巨噬細(xì)胞吞噬腫瘤細(xì)胞。CD47 的阻斷可能導(dǎo)致CRT 水平升高,這是巨噬細(xì)胞識(shí)別所必需的,因此會(huì)觸發(fā) CRT 介導(dǎo)的吞噬作用。


越來越多的證據(jù)表明,由脂多糖(LPS)和其他促炎細(xì)胞因子(如 IFN-γ)激活的 M1 巨噬細(xì)胞可殺死腫瘤細(xì)胞,抑制血管生成,并通過巨噬細(xì)胞消除癌細(xì)胞來改善預(yù)后。許多研究報(bào)告了使用體外誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞模型消除癌細(xì)胞。然而,與這種誘導(dǎo)相關(guān)的重要免疫參數(shù),特別是在 AML 中,仍未*闡明。


基于此,加拿大國(guó)家研究委員會(huì)計(jì)量研究中心、多倫多大學(xué)化學(xué)工程系、西奈山醫(yī)學(xué)院病理學(xué)和檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)系的聯(lián)合團(tuán)隊(duì)使用人類巨噬細(xì)胞和癌細(xì)胞共培養(yǎng)證明了一種同時(shí)抑制 CD47 和提高 CRT 表達(dá)水平以消除 AML 的新模型,并使用不同濃度(0–100 ng/mL)的 LPS評(píng)估了幾個(gè)免疫反應(yīng)參數(shù)和相關(guān)的生物標(biāo)志物表達(dá)。該研究結(jié)果為篩選抗AML藥物提供了一種新的共培養(yǎng)方法。







共培養(yǎng)時(shí)在 HL-60 白血病細(xì)胞上同時(shí)下調(diào) CD47 和增加 CRT 表達(dá)


在這項(xiàng)研究中,假設(shè)白血病細(xì)胞中 CD47 表達(dá)的下調(diào)可以增加共培養(yǎng)中巨噬細(xì)胞對(duì)它們的消除。為了驗(yàn)證這一假設(shè),人類 HL-60 細(xì)胞(人早幼粒急性白血病細(xì)胞)首先與 THP-1 巨噬細(xì)胞在配對(duì)室中共培養(yǎng)(圖1 a  ),將 0、5、20 100 ng/mL LPS 添加到含有 THP-1 巨噬細(xì)胞的底部室中,并孵育 16-18 小時(shí),然后評(píng)估共培養(yǎng)后 HL-60 上的 CD47 CRT 水平。


如圖1 b 所示,HL-60 上的 CD47 水平隨著用于刺激 THP-1 巨噬細(xì)胞的 LPS 量(ng/mL)的增加而降低(圖1 b)。令人驚訝的是,HL-60 上的 CRT 水平也隨著 LPS 劑量的增加而增加(圖1 c)。THP-1 巨噬細(xì)胞的刺激導(dǎo)致CD47 的下調(diào),有趣的是它增加了 HL-60 細(xì)胞表面的CRT 水平。CD47 水平在 0 ng/mL LPS 時(shí)最高,CRT 水平在 0 ng/mL LPS 時(shí)效果相反 (圖1 b、c)。在用于刺激與 HL-60 細(xì)胞共培養(yǎng)的 THP-1 巨噬細(xì)胞的所有 LPS 濃度下都可以看到這種模式(圖1 bc)。CD47 水平在 100 ng/mL LPS 下顯示 81% 的下調(diào),在 5-20 ng/mL LPS 下顯示 32-77% 的下調(diào)(圖1 b)。


其次,檢查 CD47 的下調(diào)是否發(fā)生在正常血細(xì)胞中。PBMC (外周血單個(gè)核細(xì)胞)正常血細(xì)胞在與 HL-60 相同的條件下與分化的 THP-1 巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)并用作對(duì)照(圖1 b)。PBMC 在所有使用的 LPS 濃度(包括 0 ng/mL)下表現(xiàn)出相似的低 CD47 表達(dá)水平(圖1 d)。CRT 水平觀察到類似的結(jié)果(圖1 e)。在LPS刺激后與THP-1巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)和單獨(dú)培養(yǎng)時(shí),在任何濃度的LPS作用下PBMC正常細(xì)胞中均未見CD47下調(diào)或CRT升高(圖1 d、e)。這些結(jié)果表明,巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞的激活和隨后 CD47 的抑制和 CRT 水平的增加可能僅對(duì)癌細(xì)胞具有選擇性,并且可以在不同濃度的激活材料下逐漸應(yīng)用。此外,CD47 的抑制和 CRT 水平的誘導(dǎo)只能在共培養(yǎng)中獲得,表明該模型具有指導(dǎo)白血病治療發(fā)展的潛力。



1   與受刺激的 THP-1 巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)后,HL-60 PBMC 中的 CD47 CRT 水平。

aTHP-1 巨噬細(xì)胞與 HL60 PBMC 在共培養(yǎng)室中共培養(yǎng)的方案。流式細(xì)胞儀分析 HL-60 細(xì)胞中的 CD47b)和 CRTc);與 THP-1 巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)后,PBMC 細(xì)胞中的CD47d)和 CRTe).




共培養(yǎng)中激活 THP-1 巨噬細(xì)胞對(duì) HL-60 的消除和細(xì)胞活力


在共培養(yǎng)中,LPS 用于激活 THP-1 巨噬細(xì)胞,并與 HL-60 白血病細(xì)胞一起孵育過夜。因此,有必要在共培養(yǎng)前研究 LPS 對(duì) HL-60 PBMC 活力的影響。此外,為了進(jìn)一步檢驗(yàn)之前的假設(shè)并研究巨噬細(xì)胞對(duì)癌細(xì)胞的消除,測(cè)定了與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)后 HL-60 PBMC(作為對(duì)照)的細(xì)胞凋亡率。


結(jié)果表明,當(dāng)這兩種細(xì)胞系單獨(dú)培養(yǎng)并用 LPS 處理時(shí),HL-60 PBMC 的活力在所有 LPS 濃度下在 16-18 小時(shí)的孵育期間保持在 90% 以上。然而,在與 THP-1 巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)后,隨著 LPS 濃度的增加,觀察到細(xì)胞凋亡增加(圖2 a、c)。HL-60 細(xì)胞的凋亡從 5 ng/mL LPS 時(shí)的 22% 增加到 100 ng/mL LPS 時(shí)的 77%(圖2 a、c)。然而,與 0 ng/mL LPS 相比,PBMC 在任何 LPS 濃度下都沒有顯示出任何顯著的細(xì)胞凋亡增加(圖 2 bc)。上述結(jié)果表明,由于 LPS 激活,巨噬細(xì)胞對(duì)癌細(xì)胞的消除具有選擇性,并且共培養(yǎng)模型是這種癌細(xì)胞消除發(fā)生所必需的。



2   LPS 激活的 THP-1 巨噬細(xì)胞在共培養(yǎng)中消除 HL-60。

HL-60a)和 PBMCb)的側(cè)散點(diǎn)圖。所有圖均顯示在 0、5、20 100 ng/mL LPS 時(shí)發(fā)生的細(xì)胞凋亡。(c)顯示與 THP-1 巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)后癌細(xì)胞和正常細(xì)胞凋亡的百分比。




共培養(yǎng)中 LPS 激活的 THP-1 巨噬細(xì)胞上 CRT CD14 水平升高


實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究了 LPS 激活的巨噬細(xì)胞上 CRT CD14 的水平及其與吞噬作用的聯(lián)系。實(shí)驗(yàn)注意到,癌細(xì)胞上生物標(biāo)志物表達(dá)的改變只發(fā)生在與巨噬細(xì)胞的共培養(yǎng)中(圖3)。這可能是它們通過 CRT 介導(dǎo)的吞噬作用消除的原因。當(dāng)與 HL-60 THP-1 癌細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí),THP-1 巨噬細(xì)胞顯示出高水平的 CRT(圖3 a-c、k)。當(dāng) THP-1 巨噬細(xì)胞與 NB4(急性早幼粒白血病細(xì)胞)共培養(yǎng)時(shí),CRT 水平相似,而與 PBMC 共培養(yǎng)時(shí),CRT 水平較低(圖3 d、e、k)。這里需要注意的是,THP-1 巨噬細(xì)胞(與癌細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí))上的 CRT 水平顯著高于?與 PBMC 正常細(xì)胞共培養(yǎng)后獲得的 CRT 水平(圖3 k),表明在共培養(yǎng)中 THP-1 巨噬細(xì)胞發(fā)生了更高水平的 CRT 改變,最終導(dǎo)致與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)發(fā)生吞噬作用和消除癌細(xì)胞。


已知 CD14 參與 LPS 的結(jié)合和隨后產(chǎn)生的促炎反應(yīng)。在實(shí)驗(yàn)結(jié)果中,當(dāng)與 HL-60 NB4 共培養(yǎng)時(shí),LPS 激活的 THP-1 巨噬細(xì)胞確實(shí)顯示出高水平的 CD14(圖3 f-h、l)。在與 PBMC 正常細(xì)胞共培養(yǎng)后,THP-1 巨噬細(xì)胞上其表達(dá)水平較低(圖3 j、l)。上述所有癌細(xì)胞均單獨(dú)培養(yǎng)并用 0、520 100 ng/mL LPS 處理,之后通過流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量其表面的 CD14。在 5 ng/mL LPS 處理后,HL60 NB4 癌細(xì)胞上的 CD14 水平?jīng)]有顯著增加。對(duì)于 THP-1 癌細(xì)胞和 PBMC 正常細(xì)胞,CD14 在所有濃度下的增加均不顯著。在 20 100 ng/mL LPS 處理時(shí),HL60 NB4 CD14 水平顯著增加,然而,當(dāng)與 THP-1 巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí),所有細(xì)胞系細(xì)胞上的 CD14 水平顯著升高(與單獨(dú)培養(yǎng)的水平相比,圖3)。類似地,單獨(dú)培養(yǎng)時(shí) THP-1 巨噬細(xì)胞上的 CD14 水平隨著 LPS 濃度的增加而增加,但這些增加的水平遠(yuǎn)低于THP-1 巨噬細(xì)胞與癌細(xì)胞共培養(yǎng)后增加的 CD14 水平(圖3 l)。這些證據(jù)表明,CRT 介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞消除癌細(xì)胞可能發(fā)生在共培養(yǎng)中。



3   與白血病細(xì)胞共培養(yǎng)后,THP-1 巨噬細(xì)胞上 CRT CD14 水平升高。

側(cè)散點(diǎn)圖的代表性示例顯示,在與 HL-60 共培養(yǎng),當(dāng)用 05、20 100 ng/mL LPS 激活時(shí),THP-1 巨噬細(xì)胞上的 CRTa)和 CD14f)水平增加。流式細(xì)胞儀直方圖顯示當(dāng)用 05、20 100 ng/mL LPS 激活,與 HL-60b、g);THP-1癌細(xì)胞(c、i);NB4d、h)和PBMC正常細(xì)胞(ej)共培養(yǎng)時(shí),THP-1巨噬細(xì)胞上的CRTb-e)和CD14g-j)水平。與 HL-60、NB4THP-1 癌細(xì)胞和 PBMC 正常細(xì)胞共培養(yǎng)后 THP-1 巨噬細(xì)胞上CRTk)和 CD14l)的水平。




LPS 激活 THP-1 巨噬細(xì)胞后 M1 巨噬細(xì)胞極化相關(guān)細(xì)胞因子水平升高


據(jù)報(bào)道,各種 CD47 抑制方法(包括使用 LPS 激活巨噬細(xì)胞)會(huì)導(dǎo)致某些細(xì)胞因子的產(chǎn)生增加并刺激吞噬作用。在該研究中,不同濃度的LPS 用于刺激 THP-1 巨噬細(xì)胞。結(jié)果,CD47 在所有使用的白血病細(xì)胞系中都被下調(diào)。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn),與對(duì)照相比,LPS 刺激以劑量依賴性方式導(dǎo)致 IL-12p70IL-6、TNF-αIL-1β、IL-10 IL-8 的顯著產(chǎn)生(圖4)。當(dāng) THP-1 巨噬細(xì)胞在 100 ng/mL LPS 下被激活時(shí),IL-12p70 比對(duì)照(0 ng/mL LPS)高 30 倍(圖4 a)。在與對(duì)照相同的 LPS 濃度下,IL-6 TNF-α 隨后增加超過 20 倍(圖4)。上述所有細(xì)胞因子都是由 M1 型巨噬細(xì)胞分泌的,主要是 LPS 刺激的結(jié)果。共培養(yǎng)培養(yǎng)基上清液中這些細(xì)胞因子的高水平存在表明THP-1巨噬細(xì)胞為M1型,其主要作用是消除癌細(xì)胞。這些結(jié)果是支持實(shí)驗(yàn)假設(shè)的另一個(gè)證據(jù),即在 LPS 刺激共培養(yǎng)中的巨噬細(xì)胞時(shí),CD47 CRT 水平發(fā)生變化以標(biāo)記癌細(xì)胞被 M1 巨噬細(xì)胞消除。這在之前的CD47CRT水平的改變以及癌細(xì)胞的消除(細(xì)胞凋亡)中得到了證明。



4   LPS 激活 THP-1 巨噬細(xì)胞后 M1 巨噬細(xì)胞極化標(biāo)志物水平升高。

a)在 0、5、20 100 ng/mL LPS 激活后,相對(duì)于 THP-1 巨噬細(xì)胞對(duì)照(0 ng/mL LPS)產(chǎn)生的細(xì)胞因子水平(pg/mL)。

bTHP-1 巨噬細(xì)胞中細(xì)胞因子水平相對(duì)于對(duì)照的倍數(shù)變化。




5 圖形概要




總之,該研究結(jié)果表明,在共培養(yǎng)中成功使用人類巨噬細(xì)胞模型在 AML 癌細(xì)胞中抑制 CD47 并上調(diào) CRT 從而增加它們的消除。此外,數(shù)據(jù)表明該模型對(duì) AML 細(xì)胞具有選擇性,并且不影響其他幾種類型的正常血細(xì)胞,這表明該模型在篩選抗 AML 新藥方面的潛力,以及未來在 AML 治療中使用人類巨噬細(xì)胞的可能性。



參考文獻(xiàn):Hassan EM, Walker GC, Wang C, Zou S. Anti-leukemia effect associated with down-regulated CD47 and up-regulated calreticulin by stimulated macrophages in co-culture. Cancer Immunol Immunother. 2021 Mar;70(3):787-801. doi: 10.1007/s00262-020-02728-z. Epub 2020 Sep 29. PMID: 32995942.




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