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人眼 Tenon 囊成纖維細(xì)胞和人角膜上皮細(xì)胞在共培養(yǎng)系統(tǒng)中的相互作用

來源:上海泉眾機電科技有限公司   2022年07月20日 09:16  


青光眼的特點是視野逐漸變窄,最終導(dǎo)致失明。大多數(shù)抗青光眼眼藥水都含有防腐劑以防止微生物的生長。苯扎氯銨(BAC)是廣泛使用的滴眼劑防腐劑。手術(shù)前長期使用含有 BAC 的青光眼滴眼液也會增加青光眼濾過手術(shù)的失敗率,這種效果被認(rèn)為反映了 BAC 誘導(dǎo)的結(jié)膜下組織纖維化。手術(shù)后濾過泡的維護仍然是青光眼臨床面臨的挑戰(zhàn)。


組織駐留的成纖維細(xì)胞,以及循環(huán)祖細(xì)胞、上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞,有可能轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞,從而促進纖維化。肌成纖維細(xì)胞的特點是過度表達 α 平滑肌肌動蛋白(αSMA)、肌動蛋白應(yīng)力纖維的形成以及細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)蛋白(如 I 型和 III 型膠原蛋白和糖蛋白)的過度產(chǎn)生,以響應(yīng)各種刺激,包括損傷、感染、炎癥和壓力。心肌素相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(MRTF)信號通路在肌成纖維細(xì)胞的分化和激活中起重要作用。已經(jīng)表明,MRTF 信號與視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)。MRTF-A 與啟動子區(qū)域結(jié)合,從而調(diào)節(jié)肌成纖維細(xì)胞相關(guān)基因的表達,例如 αSMA、纖連蛋白和結(jié)締組織生長因子(CTGF)的表達。免疫系統(tǒng)有助于肌成纖維細(xì)胞的調(diào)節(jié),而抗炎細(xì)胞因子白細(xì)胞介素(IL-10 是調(diào)節(jié)組織重塑的潛在治療靶點。


與相應(yīng)的正常組織相比,青光眼手術(shù)后濾過失敗結(jié)構(gòu)的組織學(xué)標(biāo)本顯示,αSMA 陽性細(xì)胞數(shù)量增加,I 型或 III 型膠原蛋白高密度沉積。BAC 被證明可以縮短兔青光眼濾過手術(shù)后的濾泡存活時間,并增加濾過泡中 αSMA 的表達。


角膜、結(jié)膜和眼瞼維持眼表穩(wěn)態(tài)并在影響每個組織的病理變化中相互作用。角膜上皮作為眼睛表面的屏障起著重要作用。這種屏障的破壞允許炎癥從結(jié)膜或眼瞼擴散到角膜。角膜上皮和結(jié)膜下組織也通過淚液相互連通。然而,角膜上皮對 BAC 誘導(dǎo)的 Tenon 囊成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞的可能影響尚不清楚。


為了解決這個問題,日本山口大學(xué)醫(yī)學(xué)部眼科的課題組研究了 BAC 在與猴病毒40SV40-永生化人角膜上皮(HCE)細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)中對人眼 Tenon 囊成纖維細(xì)胞(HTFs)轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞的影響,此外還檢查了釋放到共培養(yǎng)上清液中的 IL-10 對該系統(tǒng)中觀察到的 BAC HTFs 的有害作用的可能保護機制。

 

 

 

 

 

BAC 對 HTFs 和 HCE 細(xì)胞的細(xì)胞毒性


首先通過測量乳酸脫氫酶(LDH)釋放量來檢查 BAC HTFs HCE 細(xì)胞活力的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),暴露于 BAC,HTFs HCE 細(xì)胞培養(yǎng)基中的 LDH 量以濃度依賴性方式增加,在 BAC 濃度≥ 10 × 10-6 % 時這種效應(yīng)顯著增加(圖1)。因此,在 5 × 10-6 % 的無毒濃度下用 BAC 進行了后續(xù)實驗。


 

 

1 BAC HTFs HCE 細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用。

將 HTFs(a)或 HCE 細(xì)胞(b)剝奪血清 24 小時,然后在不存在(對照)或存在不同濃度 BAC 的情況下孵育 24 小時,然后測量釋放到培養(yǎng)基中的 LDH 量。




BAC HTF 轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞的影響


接下來檢查了無毒濃度的 BAC HTFs 表型的影響。免疫熒光分析顯示,BAC 誘導(dǎo)肌成纖維細(xì)胞分化的關(guān)鍵標(biāo)志物 αSMA 在這些細(xì)胞中顯著表達(圖2 a)。免疫印跡分析證實,BAC 誘導(dǎo) HTFs αSMA 豐度顯著增加(2.02 倍,與 BAC 未處理相比,圖2 b)。


 

 

2 BAC HTFs 轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞的影響。

(a)HTF 被剝奪血清 24 小時,在不存在或存在 BAC的情況下孵育 24 小時,然后用 αSMA 抗體(綠色)進行免疫熒光染色。用 DAPI(藍色)對細(xì)胞核進行復(fù)染。

(b)用針對 αSMA 和 α-微管蛋白的抗體對(a)中處理的細(xì)胞進行免疫印跡分析。




HCE 細(xì)胞對 BAC 誘導(dǎo)的 HTFs 轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞的影響


鑒于角膜上皮和結(jié)膜下組織(包括 Tenon 囊成纖維細(xì)胞)通過淚液相互作用,于是在共培養(yǎng)系統(tǒng)中檢測了 HCE 細(xì)胞對 BAC 誘導(dǎo)的 HTFs 的肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的影響。免疫熒光分析顯示,在不存在 HCE 細(xì)胞的情況下,HTFs 可表達出 BAC 誘導(dǎo)的 αSMA ,而在與 HCE 細(xì)胞共培養(yǎng)的 HTFs 中,這種效應(yīng)被大大抑制(圖3 a)。這些結(jié)果通過免疫印跡分析得到證實(圖3 b)。


 

 

3 在共培養(yǎng)系統(tǒng)中,HCE 細(xì)胞對 BAC 誘導(dǎo)的 HTFs 轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞的影響。

(a)在含有(或不含有)HCE 細(xì)胞的插入物中培養(yǎng)的 HTFs 被剝奪血清 24 小時,在不存在或存在 BAC的情況下孵育 24 小時,和然后用 αSMA(綠色)抗體進行免疫熒光染色。細(xì)胞核用 DAPI(藍色)復(fù)染。

(b)用 αSMA 抗體對(a)中處理的 HTFs 進行免疫印跡分析。




BAC HTF/HCE 細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)中細(xì)胞因子釋放的影響


為了探索 HCE 細(xì)胞可能抑制 BAC 誘導(dǎo)的 HTFs αSMA 表達的機制,實驗測量了釋放到培養(yǎng)基中的 IL-6、單核細(xì)胞趨化蛋白1MCP-1)和 IL-10 的濃度。BAC 處理的 單獨培養(yǎng)的 HTFs 的上清液中 IL-6 MCP-1 的水平顯著高于 BAC 處理的 HTFs HCE 細(xì)胞的共培養(yǎng)物中的水平(圖4 a)。在有或沒有 BAC 的情況下,HTF/HCE 細(xì)胞共培養(yǎng)物的 IL-6 MCP-1 水平?jīng)]有顯著差異。相比之下,BAC 處理的單獨培養(yǎng)的 HTFs 培養(yǎng)基中 IL-10 的濃度僅為 BAC 處理的 HTF HCE 細(xì)胞共培養(yǎng)中的 5.79%(圖4 a)。同樣,在有或沒有 BAC 的情況下,HTF/HCE 細(xì)胞共培養(yǎng)物的 IL-10 水平?jīng)]有顯著差異。


為了檢查這兩種細(xì)胞類型中的哪一種可能負(fù)責(zé)產(chǎn)生 IL-10,實驗還通過逆轉(zhuǎn)錄(RT)和定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)分析在 HTFs HCE 細(xì)胞共培養(yǎng)后 IL-10 mRNA 的豐度。雖然共培養(yǎng)物之間 HTFsIL-10 mRNA 的量在有或沒有 BAC 下沒有顯著差異,但在 HCE 細(xì)胞中,IL-10 mRNA的表達量在BAC維持下顯著增加(1.32 倍,與沒有 BAC HCE 相比,圖4 b)。


 

 

圖4 BAC 對 HTF/HCE 細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)中細(xì)胞因子釋放的影響。

(a)在含有(或不含有)HCE 細(xì)胞的插入物中培養(yǎng)的 HTFs 被剝奪血清 24 小時,然后在不存在或存在 BAC 的情況下孵育 24 小時,之后測量HTF培養(yǎng)上清液中IL-6、MCP-1和IL-10的水平。

(b)HTFs 和 HCE 細(xì)胞共培養(yǎng)和如(a)處理,之后通過 RT-qPCR 分析確定兩種細(xì)胞類型中 IL-10 mRNA 的豐度。




IL-10 BAC 誘導(dǎo)的 HTFs 轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞的影響


鑒于在存在 BAC 的情況下,HTF/HCE 細(xì)胞共培養(yǎng)物的培養(yǎng)上清液中的 IL-10 水平與單獨培養(yǎng)的 HTF 相比增加,因此假設(shè) IL-10 可能有助于 HCE 細(xì)胞減弱 BAC 誘導(dǎo)的HTFs 轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞。于是檢查了外源性 IL-10 是否可能抑制 BAC 的這種作用。HTFs IL-10300 pg/ml)在無血清培養(yǎng)基中孵育 24 小時,然后再暴露于 BAC 24 小時。免疫熒光染色(圖5 a)和免疫印跡分析(圖5 b)表明,在存在 IL-10 的情況下,HTFs BAC 誘導(dǎo)的 αSMA 表達基本上被消除了。


 

 

圖5 IL-10 對 BAC 誘導(dǎo)的 HTFs 轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞的影響。

(a)HTFs 首先在有或沒有 IL-10(300 pg/ml)的情況下孵育 24 小時,然后在額外不存在或存在 BAC 的情況下孵育 24 小時,之后對細(xì)胞進行處理用 αSMA(綠色)抗體進行免疫熒光染色。細(xì)胞核用 DAPI(藍色)復(fù)染。

(b)用(a)中處理的細(xì)胞用 αSMA 抗體進行免疫印跡分析。




BAC IL-10 HTFs MRTF-A 亞細(xì)胞定位的影響


之前研究表明,EMT 是通過視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中的 MRTF-A 信號通路介導(dǎo)的。因此研究了 MRTF-A 信號通路是否也可能在 BAC 誘導(dǎo)的 HTFs 轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞中發(fā)揮作用。免疫熒光分析顯示,在沒有 BAC 的情況下,MRTF-A 主要定位于 HTFs 的細(xì)胞質(zhì),而在暴露于 BAC 的細(xì)胞中,它已易位至細(xì)胞核(圖6 a)。重要的是,BAC MRTF-A 定位的這種影響被 IL-10 抑制。免疫印跡分析證實了 BAC 誘導(dǎo)的 MRTF-A 易位至細(xì)胞核,并且在暴露于 IL-10 的細(xì)胞中其顯著減弱 39.32%(圖6 b)。


 

 

圖6 BAC 和 IL-10 對 MRTF-A 在 HTFs 中亞細(xì)胞定位的影響。

(a)HTFs 首先在有或沒有 IL-10(300 pg/ml)的情況下孵育 24 小時,然后在額外不存在或存在 BAC 的情況下孵育 6 小時,之后對細(xì)胞進行處理用 MRTF-A 抗體(綠色)進行免疫熒光染色。細(xì)胞核用 DAPI(藍色)復(fù)染。

(b)(a)中處理的細(xì)胞,除了將它們暴露(或不暴露)于 BAC 24 小時外,對它們進行亞細(xì)胞分離,并用針對 MRTF-A 和核纖層蛋白 A/C(核標(biāo)記物)的抗體對核部分進行免疫印跡分析。




總之,該研究檢查了 HTFs HCE 細(xì)胞在共培養(yǎng)系統(tǒng)中的相互作用。研究發(fā)現(xiàn),HCE 細(xì)胞抑制 BAC 誘導(dǎo)的 HTFs 轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞,并且 HCE 細(xì)胞的這種作用被 IL-10 模擬。盡管兩種細(xì)胞類型之間這種相互作用的確切機制尚不清楚,但它可能在 IL-10 的產(chǎn)生水平上介導(dǎo),因為 HCE 細(xì)胞存在時 HTFs 培養(yǎng)上清液中 IL-10 的濃度增加。BAC 還誘導(dǎo) HTFs MRTF-A 的核轉(zhuǎn)位,并且這種作用再次被 IL-10 抑制,表明 MRTF-A 介導(dǎo)了 BAC HTFs 轉(zhuǎn)分化的影響。進一步的研究需要確定在該通路中作用于 MRTF-A 上游的蛋白,以及研究 IL-10 是否可能在體內(nèi)抑制 BAC 誘導(dǎo)的結(jié)膜下纖維化。




參考文獻:Yamashiro C, Tokuda K, Kobayashi Y, Higashijima F, Yoshimoto T, Ota M, Ogata T, Ashimori A, Kobayashi M, Hatano M, Uchi SH, Wakuta M, Teranishi S, Kimura K. Benzalkonium chloride-induced myofibroblastic transdifferentiation of Tenon's capsule fibroblasts is inhibited by coculture with corneal epithelial cells or by interleukin-10. Sci Rep. 2021 Aug 9;11(1):16096. doi: 10.1038/s41598-021-94852-8. PMID: 34373467; PMCID: PMC8352883.

 

 

 

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