青光眼的特點(diǎn)是視野逐漸變窄，最終導(dǎo)致失明。大多數(shù)抗青光眼眼藥水都含有防腐劑以防止微生物的生長。苯扎氯銨（BAC）是廣泛使用的滴眼劑防腐劑。手術(shù)前長期使用含有 BAC 的青光眼滴眼液也會增加青光眼濾過手術(shù)的失敗率，這種效果被認(rèn)為反映了 BAC 誘導(dǎo)的結(jié)膜下組織纖維化。手術(shù)后濾過泡的維護(hù)仍然是青光眼臨床面臨的挑戰(zhàn)。

組織駐留的成纖維細(xì)胞，以及循環(huán)祖細(xì)胞、上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，有可能轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞，從而促進(jìn)纖維化。肌成纖維細(xì)胞的特點(diǎn)是過度表達(dá) α 平滑肌肌動蛋白（αSMA）、肌動蛋白應(yīng)力纖維的形成以及細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）蛋白（如 I 型和 III 型膠原蛋白和糖蛋白）的過度產(chǎn)生，以響應(yīng)各種刺激，包括損傷、感染、炎癥和壓力。心肌素相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（MRTF）信號通路在肌成纖維細(xì)胞的分化和激活中起重要作用。已經(jīng)表明，MRTF 信號與視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)。MRTF-A 與啟動子區(qū)域結(jié)合，從而調(diào)節(jié)肌成纖維細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)，例如 αSMA、纖連蛋白和結(jié)締組織生長因子（CTGF）的表達(dá)。免疫系統(tǒng)有助于肌成纖維細(xì)胞的調(diào)節(jié)，而抗炎細(xì)胞因子白細(xì)胞介素（IL）-10 是調(diào)節(jié)組織重塑的潛在治療靶點(diǎn)。

與相應(yīng)的正常組織相比，青光眼手術(shù)后濾過失敗結(jié)構(gòu)的組織學(xué)標(biāo)本顯示，αSMA 陽性細(xì)胞數(shù)量增加，I 型或 III 型膠原蛋白高密度沉積。BAC 被證明可以縮短兔青光眼濾過手術(shù)后的濾泡存活時間，并增加濾過泡中 αSMA 的表達(dá)。

角膜、結(jié)膜和眼瞼維持眼表穩(wěn)態(tài)并在影響每個組織的病理變化中相互作用。角膜上皮作為眼睛表面的屏障起著重要作用。這種屏障的破壞允許炎癥從結(jié)膜或眼瞼擴(kuò)散到角膜。角膜上皮和結(jié)膜下組織也通過淚液相互連通。然而，角膜上皮對 BAC 誘導(dǎo)的 Tenon 囊成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞的可能影響尚不清楚。

為了解決這個問題，日本山口大學(xué)醫(yī)學(xué)部眼科的課題組研究了 BAC 在與猴病毒40（SV40）-永生化人角膜上皮（HCE）細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)中對人眼 Tenon 囊成纖維細(xì)胞（HTFs）轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞的影響，此外還檢查了釋放到共培養(yǎng)上清液中的 IL-10 對該系統(tǒng)中觀察到的 BAC 對 HTFs 的有害作用的可能保護(hù)機(jī)制。

BAC 對 HTFs 和 HCE 細(xì)胞的細(xì)胞毒性

首先通過測量乳酸脫氫酶（LDH）釋放量來檢查 BAC 對 HTFs 和 HCE 細(xì)胞活力的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，暴露于 BAC，HTFs 或 HCE 細(xì)胞培養(yǎng)基中的 LDH 量以濃度依賴性方式增加，在 BAC 濃度≥ 10 × 10^-6 % 時這種效應(yīng)顯著增加（圖1）。因此，在 5 × 10^-6 % 的無毒濃度下用 BAC 進(jìn)行了后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 BAC 對 HTFs 和 HCE 細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用。

將 HTFs（a）或 HCE 細(xì)胞（b）剝奪血清 24 小時，然后在不存在（對照）或存在不同濃度 BAC 的情況下孵育 24 小時，然后測量釋放到培養(yǎng)基中的 LDH 量。

BAC 對 HTF 轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞的影響

接下來檢查了無毒濃度的 BAC 對 HTFs 表型的影響。免疫熒光分析顯示，BAC 誘導(dǎo)肌成纖維細(xì)胞分化的關(guān)鍵標(biāo)志物 αSMA 在這些細(xì)胞中顯著表達(dá)（圖2 a）。免疫印跡分析證實(shí)，BAC 誘導(dǎo) HTFs 中 αSMA 豐度顯著增加（2.02 倍，與 BAC 未處理相比，圖2 b）。

圖2 BAC 對 HTFs 轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞的影響。

（a）HTF 被剝奪血清 24 小時，在不存在或存在 BAC的情況下孵育 24 小時，然后用 αSMA 抗體（綠色）進(jìn)行免疫熒光染色。用 DAPI（藍(lán)色）對細(xì)胞核進(jìn)行復(fù)染。

（b）用針對 αSMA 和 α-微管蛋白的抗體對（a）中處理的細(xì)胞進(jìn)行免疫印跡分析。

HCE 細(xì)胞對 BAC 誘導(dǎo)的 HTFs 轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞的影響

鑒于角膜上皮和結(jié)膜下組織（包括 Tenon 囊成纖維細(xì)胞）通過淚液相互作用，于是在共培養(yǎng)系統(tǒng)中檢測了 HCE 細(xì)胞對 BAC 誘導(dǎo)的 HTFs 的肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的影響。免疫熒光分析顯示，在不存在 HCE 細(xì)胞的情況下，HTFs 可表達(dá)出 BAC 誘導(dǎo)的 αSMA ，而在與 HCE 細(xì)胞共培養(yǎng)的 HTFs 中，這種效應(yīng)被大大抑制（圖3 a）。這些結(jié)果通過免疫印跡分析得到證實(shí)（圖3 b）。

圖3 在共培養(yǎng)系統(tǒng)中，HCE 細(xì)胞對 BAC 誘導(dǎo)的 HTFs 轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞的影響。

（a）在含有（或不含有）HCE 細(xì)胞的插入物中培養(yǎng)的 HTFs 被剝奪血清 24 小時，在不存在或存在 BAC的情況下孵育 24 小時，和然后用 αSMA（綠色）抗體進(jìn)行免疫熒光染色。細(xì)胞核用 DAPI（藍(lán)色）復(fù)染。

（b）用 αSMA 抗體對（a）中處理的 HTFs 進(jìn)行免疫印跡分析。

BAC 對 HTF/HCE 細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)中細(xì)胞因子釋放的影響

為了探索 HCE 細(xì)胞可能抑制 BAC 誘導(dǎo)的 HTFs 中 αSMA 表達(dá)的機(jī)制，實(shí)驗(yàn)測量了釋放到培養(yǎng)基中的 IL-6、單核細(xì)胞趨化蛋白1（MCP-1）和 IL-10 的濃度。BAC 處理的 單獨(dú)培養(yǎng)的 HTFs 的上清液中 IL-6 和 MCP-1 的水平顯著高于 BAC 處理的 HTFs 和 HCE 細(xì)胞的共培養(yǎng)物中的水平（圖4 a）。在有或沒有 BAC 的情況下，HTF/HCE 細(xì)胞共培養(yǎng)物的 IL-6 和 MCP-1 水平?jīng)]有顯著差異。相比之下，BAC 處理的單獨(dú)培養(yǎng)的 HTFs 培養(yǎng)基中 IL-10 的濃度僅為 BAC 處理的 HTF 和 HCE 細(xì)胞共培養(yǎng)中的 5.79%（圖4 a）。同樣，在有或沒有 BAC 的情況下，HTF/HCE 細(xì)胞共培養(yǎng)物的 IL-10 水平?jīng)]有顯著差異。

為了檢查這兩種細(xì)胞類型中的哪一種可能負(fù)責(zé)產(chǎn)生 IL-10，實(shí)驗(yàn)還通過逆轉(zhuǎn)錄（RT）和定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）分析在 HTFs 和 HCE 細(xì)胞共培養(yǎng)后 IL-10 mRNA 的豐度。雖然共培養(yǎng)物之間 HTFs中 IL-10 mRNA 的量在有或沒有 BAC 下沒有顯著差異，但在 HCE 細(xì)胞中，IL-10 mRNA的表達(dá)量在BAC維持下顯著增加（1.32 倍，與沒有 BAC 的 HCE 相比，圖4 b）。

圖4 BAC 對 HTF/HCE 細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)中細(xì)胞因子釋放的影響。

（a）在含有（或不含有）HCE 細(xì)胞的插入物中培養(yǎng)的 HTFs 被剝奪血清 24 小時，然后在不存在或存在 BAC 的情況下孵育 24 小時，之后測量HTF培養(yǎng)上清液中IL-6、MCP-1和IL-10的水平。

（b）HTFs 和 HCE 細(xì)胞共培養(yǎng)和如（a）處理，之后通過 RT-qPCR 分析確定兩種細(xì)胞類型中 IL-10 mRNA 的豐度。

IL-10 對 BAC 誘導(dǎo)的 HTFs 轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞的影響

鑒于在存在 BAC 的情況下，HTF/HCE 細(xì)胞共培養(yǎng)物的培養(yǎng)上清液中的 IL-10 水平與單獨(dú)培養(yǎng)的 HTF 相比增加，因此假設(shè) IL-10 可能有助于 HCE 細(xì)胞減弱 BAC 誘導(dǎo)的HTFs 轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞。于是檢查了外源性 IL-10 是否可能抑制 BAC 的這種作用。HTFs 與 IL-10（300 pg/ml）在無血清培養(yǎng)基中孵育 24 小時，然后再暴露于 BAC 24 小時。免疫熒光染色（圖5 a）和免疫印跡分析（圖5 b）表明，在存在 IL-10 的情況下，HTFs 中 BAC 誘導(dǎo)的 αSMA 表達(dá)基本上被消除了。

圖5 IL-10 對 BAC 誘導(dǎo)的 HTFs 轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞的影響。

（a）HTFs 首先在有或沒有 IL-10(300 pg/ml）的情況下孵育 24 小時，然后在額外不存在或存在 BAC 的情況下孵育 24 小時，之后對細(xì)胞進(jìn)行處理用 αSMA（綠色）抗體進(jìn)行免疫熒光染色。細(xì)胞核用 DAPI（藍(lán)色）復(fù)染。

（b）用（a）中處理的細(xì)胞用 αSMA 抗體進(jìn)行免疫印跡分析。

BAC 和 IL-10 對 HTFs 中 MRTF-A 亞細(xì)胞定位的影響

之前研究表明，EMT 是通過視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中的 MRTF-A 信號通路介導(dǎo)的。因此研究了 MRTF-A 信號通路是否也可能在 BAC 誘導(dǎo)的 HTFs 轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞中發(fā)揮作用。免疫熒光分析顯示，在沒有 BAC 的情況下，MRTF-A 主要定位于 HTFs 的細(xì)胞質(zhì)，而在暴露于 BAC 的細(xì)胞中，它已易位至細(xì)胞核（圖6 a）。重要的是，BAC 對 MRTF-A 定位的這種影響被 IL-10 抑制。免疫印跡分析證實(shí)了 BAC 誘導(dǎo)的 MRTF-A 易位至細(xì)胞核，并且在暴露于 IL-10 的細(xì)胞中其顯著減弱 39.32%（圖6 b）。

圖6 BAC 和 IL-10 對 MRTF-A 在 HTFs 中亞細(xì)胞定位的影響。

（a）HTFs 首先在有或沒有 IL-10（300 pg/ml）的情況下孵育 24 小時，然后在額外不存在或存在 BAC 的情況下孵育 6 小時，之后對細(xì)胞進(jìn)行處理用 MRTF-A 抗體（綠色）進(jìn)行免疫熒光染色。細(xì)胞核用 DAPI（藍(lán)色）復(fù)染。

（b）（a）中處理的細(xì)胞，除了將它們暴露（或不暴露）于 BAC 24 小時外，對它們進(jìn)行亞細(xì)胞分離，并用針對 MRTF-A 和核纖層蛋白 A/C（核標(biāo)記物）的抗體對核部分進(jìn)行免疫印跡分析。

總之，該研究檢查了 HTFs 和 HCE 細(xì)胞在共培養(yǎng)系統(tǒng)中的相互作用。研究發(fā)現(xiàn)，HCE 細(xì)胞抑制 BAC 誘導(dǎo)的 HTFs 轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞，并且 HCE 細(xì)胞的這種作用被 IL-10 模擬。盡管兩種細(xì)胞類型之間這種相互作用的確切機(jī)制尚不清楚，但它可能在 IL-10 的產(chǎn)生水平上介導(dǎo)，因?yàn)?HCE 細(xì)胞存在時 HTFs 培養(yǎng)上清液中 IL-10 的濃度增加。BAC 還誘導(dǎo) HTFs 中 MRTF-A 的核轉(zhuǎn)位，并且這種作用再次被 IL-10 抑制，表明 MRTF-A 介導(dǎo)了 BAC 對 HTFs 轉(zhuǎn)分化的影響。進(jìn)一步的研究需要確定在該通路中作用于 MRTF-A 上游的蛋白，以及研究 IL-10 是否可能在體內(nèi)抑制 BAC 誘導(dǎo)的結(jié)膜下纖維化。

參考文獻(xiàn)：Yamashiro C, Tokuda K, Kobayashi Y, Higashijima F, Yoshimoto T, Ota M, Ogata T, Ashimori A, Kobayashi M, Hatano M, Uchi SH, Wakuta M, Teranishi S, Kimura K. Benzalkonium chloride-induced myofibroblastic transdifferentiation of Tenon's capsule fibroblasts is inhibited by coculture with corneal epithelial cells or by interleukin-10. Sci Rep. 2021 Aug 9;11(1):16096. doi: 10.1038/s41598-021-94852-8. PMID: 34373467; PMCID: PMC8352883.

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