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威尼德分子雜交儀:Western blot 實(shí)驗(yàn)原理及試驗(yàn)步驟

來(lái)源:威尼德生物科技(北京)有限公司   2022年07月23日 10:36  

    經(jīng)典實(shí)驗(yàn)步驟是將提取的蛋白電泳轉(zhuǎn)膜 --- 一抗孵育 --- 二抗孵育 --- 底物顯色 --- 分析。我這幾天幾乎都在重復(fù)著這個(gè)過(guò)程,現(xiàn)在將自己試驗(yàn)過(guò)程記錄下來(lái),和大家一起分享,希望對(duì)新手有所幫助。

1.蛋白提取

     傳統(tǒng)方法是(1)組織稱重(2) 利用液氮、研缽粉碎組織塊(3) 加入RIPA緩沖液,PMSF(4)勻漿(15,000轉(zhuǎn)/*1分鐘)維持4℃(5)加入PMSF冰上孵育30分鐘,移入離心管4℃ 離心15分鐘(6)上清液為細(xì)胞裂解液可分裝-20℃保存。一部分進(jìn)行Bradford比色法 測(cè)定蛋白質(zhì)濃度, 取相同質(zhì)量的細(xì)胞裂解液(體積*蛋白質(zhì)濃度)進(jìn)行電泳。

    小結(jié) 現(xiàn)在有許多公司提供即用的蛋白提取試劑或者試劑盒,如生興生物 代理的Pierce系列產(chǎn)品,針對(duì)不同動(dòng)物組織、真核等蛋白的提取試劑盒,以及RIPA緩沖液,PMSF等即用型試劑,免去了復(fù)雜繁瑣的提取過(guò)程,高效方便。

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2. 蛋白電泳(SDS-PAGE)

(1) SDS-PAGE凝膠配制

    SDS-PAGE凝膠可以參考一些文獻(xiàn)資料進(jìn)行配制,也可以使用現(xiàn)成的SDS-PAGE凝膠配制試劑盒

(2) 樣品處理

    在收集的蛋白樣品中加入適量濃縮的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(2X5X)??梢宰孕信渲啤?/span>

(3) 上樣與電泳

    這一步主要是要注意電泳的電壓選擇和蛋白標(biāo)準(zhǔn)的選擇,為了便于觀察電泳效果和轉(zhuǎn)膜效果,以及判斷蛋白分子量大小,最好使用預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)

3. 轉(zhuǎn)膜

    具體的轉(zhuǎn)膜時(shí)間要根據(jù)目的蛋白的大小而定,目的蛋白的分子量越大,需要的轉(zhuǎn)膜時(shí)間越長(zhǎng),目的蛋白的分子量越小,需要的轉(zhuǎn)膜時(shí)間越短。實(shí)驗(yàn)中常選用PVDF膜和硝酸纖維素膜(NC),但硝酸纖維素膜比較脆,推薦使用PVDF膜。轉(zhuǎn)膜的效果用麗春紅染色液或者考馬斯亮藍(lán)快速染色液對(duì)完成轉(zhuǎn)膜的SDS-PAGE膠進(jìn)行染色,以觀察蛋白的殘留情況。

    小結(jié)   PVDF Western轉(zhuǎn)膜液 質(zhì)量都比較好,染色液的染色結(jié)果清晰,便于觀察結(jié)果,所以推薦在試驗(yàn)中使用。

4. 封閉

    這一步一定要保濕,避免膜的干燥,否則極易產(chǎn)生較高的背景。加入Western封閉液封閉(脫脂奶粉 或者BSA)。一般采用BSA或者脫脂奶粉,建議最好使用BSA或?qū)S玫拿撝谭圻M(jìn)行封閉,雖然貴點(diǎn),但還是有個(gè)好點(diǎn)的結(jié)果比較好。

5. 一抗孵育

    參考一抗的說(shuō)明書(shū),按照適當(dāng)比例用Western一抗稀釋液稀釋一抗

6. 二抗孵育

    參考二抗的說(shuō)明書(shū),按照適當(dāng)比例用Western二抗稀釋液稀釋辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗。

7. Westernblot 試劑盒顯色及蛋白檢測(cè)

    參考相關(guān)說(shuō)明書(shū),使用相應(yīng)的熒光檢測(cè)試劑等ECL類(lèi)試劑來(lái)檢測(cè)蛋白。洗片時(shí)可以使用X光片自動(dòng)洗片機(jī)。如果沒(méi)有自動(dòng)洗片機(jī),可以用顯影定影試劑盒 自行配制顯影液和定影液進(jìn)行手工洗片。

8. 膜的重復(fù)利用

    如果蛋白樣品非常寶貴,可以使用Western一抗二抗去除液處理蛋白膜,以重復(fù)利用蛋白膜。

9. 分析比較記錄

主要試劑丙烯酰胺和NN’-亞甲雙丙烯酰胺、十二烷基硫酸鈉SDS溶液、濃縮膠緩沖液、TEMED原溶液、SDS-PAGE加樣緩沖液、Tris-甘氨酸電泳緩沖液、轉(zhuǎn)移緩沖液、麗春紅染液儲(chǔ)存液、脫脂奶粉、NaN3 0.02% 疊氮鈉、Tween20、一抗、標(biāo)記二抗、NBTBCIP、100mmol/LTris-HCL(pH9.5)、100mmol/L NaCl50mmol/LTris-HCL(pH7.5)、5mmol/L EDTA等。


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