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威尼德分子雜交儀:Western試驗問題歸納與總結

來源:威尼德生物科技(北京)有限公司   2022年07月23日 10:45  

 Q1: PVDF膜和硝酸膜結合蛋白的原理是什么?

A1:一般而言,硝酸纖維素膜是通過疏水作用來和蛋白質相聯(lián),若反復洗幾次后,蛋白容易掉下來,效果較差。尼龍膜主要通過它膜上的正電荷和蛋白接合(注:常用的PVDF膜即帶正電荷的尼龍膜),同時也有疏水作用,但相對較弱。這樣的話,PVDF膜和蛋白接合較牢,不易脫落,效果較好。


    Q2:做組織樣品的western blot的時候,處理樣品有什么訣竅?

A2: 必須進行研磨、勻漿、超聲處理,蛋白質溶解度會更好,離心要充分,膜蛋白需用更劇烈的方法抽提,低豐度膜蛋白可能還要分步抽提(超速離心)。還有一點就是組織中的蛋白酶活性更強,需要注意抑制蛋白酶的活性(加入PMSF和蛋白酶抑制劑),封閉劑一般5%脫脂奶粉。如果一抗為多克隆抗體,使用BSA也是不錯的選擇

    Q3:免疫組化和Western blot可以用同一種抗體嗎?

A3: 免疫組化時抗體識別的是未經變性處理的抗原決定簇(又稱表位),有些表位是線性的,而有的屬于構象型;線性表位不受蛋白變性的影響,天然蛋白和煮后的蛋白都含有;構象型表位由于受蛋白空間結構限制,煮后變性會消失。如果你所用的抗體識別的是蛋白上連續(xù)的幾個氨基酸,也就是線性表位,那么這種抗體可同時用于免疫組化和Western blotting,而如果抗體識別構象形表位,則只能用于免疫組化。一般抗體說明書上都有注明此種抗體識別的氨基酸區(qū)間。(限于單抗)

    Q4: 不能很好地將大分子量蛋白轉移到膜上, 轉移效率低怎么樣解決?

A4: 可以考慮:轉移緩沖液中加入20%甲醇(是指終濃度)(優(yōu)化的轉移緩沖液,可以參考《蛋白質技術手冊》),因為甲醇可降低蛋白質洗脫效率,但可增加蛋白質和NC膜的結合能力,甲醇可以防止凝膠變形,甲醇對高分子量蛋白質可延長轉移時間;轉移緩沖液加入終濃度0.1%SDS,也是為了增加轉移效率;用優(yōu)質的轉移膜,或使用小孔徑的NC膜(0.2微米);使用戊二醛交聯(lián);低濃度膠,如低至6%。太大時還可以考慮用瓊脂糖膠;提高轉移電壓/電流;增加轉移時間。

    Q5:Western blot哪種染色好?

A5: (1)陰離子染料是常用的,特別是氨基黑,脫色快,背景低檢測極限可達到 1.5μg,考馬斯亮藍雖然與氨基黑有相同的靈敏度,但脫色慢,背景高。麗春紅S和快綠在檢測后容易從蛋白質中除去,以便進行隨后的氨基酸分析。缺點是:溶劑系統(tǒng)的甲醇會引起硝化纖維素膜的皺縮或破壞,不能用于帶正電荷的膜。靈敏度低。

(2)膠體金,靈敏度高,檢測范圍可到pg級,但染色比較穩(wěn)定。

3)生物素化靈敏度位于1、2之間,可用于任何一種膜。

    Q6: Western檢測基因轉染后細胞培養(yǎng)上清中表達的目的蛋白(定性),分子量為20KD,濃度約為幾百ng/ml。蛋白樣品是否需濃縮、純化?如何濃縮、純化上清液中的目的蛋白?對小分子蛋白Western blot時需特別注意哪些條件?

A6:按照提供的濃度,如果做Western blot,是不用濃縮樣品的. 對于20kd的小分子的蛋白,Western Blot中要注意的是:

    1、轉移時的時間,

    2、轉移時的電流或電壓.

    3、transfer buffer 中加20%的甲醇.

    4、可以用13-15%的分離膠.

    Q7: 半干法轉移與膠的面積和蛋白分子兩大小有一定關系,那么濕法轉移是不是所有的轉移條件都一樣呢?一般的條件是怎樣的?

A7:半干轉的電流大小是按照面積來算的,時間是根據(jù)蛋白分子大小定的;而濕轉的話電流是恒定的,時間也是根據(jù)分子量而定。

    Q8: 采用生物素標記的二抗-SABC-DAB檢測系統(tǒng)做western,非特異性的條帶和背景很高,總蛋白考染的時候發(fā)現(xiàn)接近積層膠的條帶比較清楚,條帶也很窄,可是越靠下面的條帶越來越寬,有的跑得都連在一起,這是什么原因,如何解決?SDS—PAGE的時候恒壓和恒流哪個好?

A8:非特異性的條帶和背景高:可能性很多,如一抗,二抗,封閉的原因都可能??偟鞍卓既镜臅r候發(fā)現(xiàn)接近積層膠的條帶比較清楚,條帶也很窄,可是越靠下面的條帶越來越寬,有的跑得都連在一起,這種現(xiàn)象是正常的。另外,也可能積層膠有問題。SDS—PAGE的時候,恒壓和恒流都可以用。

    Q9: 血清樣品進行Western blot 分析,目的蛋白21kD,結果顯色出來后,目的條帶很淡,而白蛋白和IgG條帶很濃,為什么?

A9:可能是因為白蛋白為67kD和目的蛋白相差較大,且其濃度較低,可以底物二氨基聯(lián)苯胺和0.01%過氧化氫溶液顯色的時間延長為30分鐘,再用去離子水漂洗以終止反應;也可能是抗體的特異性不好。把封閉的時間延長,同時提高封閉液的濃度,可以減少以下背景噪音。同時洗的時候要*,而目的條帶弱,說明濃度不足,如果不考慮后續(xù)功能的話,可過G-50(細)柱子,純化靶蛋白,接著真空冷凍濃縮,可以得到很好的結果。

    Q10: Western轉膜已經成功了,但是Marker泳道未見蛋白條帶,其余各泳道均有清晰的蛋白條帶,經考馬斯亮藍染膠,結果相同。經5%的脫脂牛奶封閉1小時45分鐘后,進行一抗孵育(1200,建議起始濃度)過夜,二抗孵育5個半小時(1:2000),均在室溫下,DAB顯色,雖出現(xiàn)蛋白條帶,但較弱,且出現(xiàn)非特異性條帶。所用Marker可分離14-116KD的蛋白,是否因為marker有問題?一抗(多克隆抗體)、二抗的濃度及孵育的時間是否合適?封閉的時間是否太短?

A101. marker有可能被降解,也有可能是上樣量太少。

     2. 建議一抗4℃孵育過夜,稀釋比為1:100;如室溫孵育,兩小時即可。

     3. 二抗室溫1小時,1:2000,或 4℃封閉過夜(室溫兩小時就夠),一抗室溫1小時,二抗室溫1小時,最好是一抗4℃過夜(或室溫2小時)1:200,二抗室溫1小時1:2000,換ECL法。

  


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