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威尼德分子雜交儀:Western試驗(yàn)問題歸納與總結(jié)

來源:威尼德生物科技(北京)有限公司   2022年07月23日 10:45  

 Q1: PVDF膜和硝酸膜結(jié)合蛋白的原理是什么?

A1:一般而言,硝酸纖維素膜是通過疏水作用來和蛋白質(zhì)相聯(lián),若反復(fù)洗幾次后,蛋白容易掉下來,效果較差。尼龍膜主要通過它膜上的正電荷和蛋白接合(注:常用的PVDF膜即帶正電荷的尼龍膜),同時(shí)也有疏水作用,但相對較弱。這樣的話,PVDF膜和蛋白接合較牢,不易脫落,效果較好。


    Q2:做組織樣品的western blot的時(shí)候,處理樣品有什么訣竅?

A2: 必須進(jìn)行研磨、勻漿、超聲處理,蛋白質(zhì)溶解度會(huì)更好,離心要充分,膜蛋白需用更劇烈的方法抽提,低豐度膜蛋白可能還要分步抽提(超速離心)。還有一點(diǎn)就是組織中的蛋白酶活性更強(qiáng),需要注意抑制蛋白酶的活性(加入PMSF和蛋白酶抑制劑),封閉劑一般5%脫脂奶粉。如果一抗為多克隆抗體,使用BSA也是不錯(cuò)的選擇

    Q3:免疫組化和Western blot可以用同一種抗體嗎?

A3: 免疫組化時(shí)抗體識(shí)別的是未經(jīng)變性處理的抗原決定簇(又稱表位),有些表位是線性的,而有的屬于構(gòu)象型;線性表位不受蛋白變性的影響,天然蛋白和煮后的蛋白都含有;構(gòu)象型表位由于受蛋白空間結(jié)構(gòu)限制,煮后變性會(huì)消失。如果你所用的抗體識(shí)別的是蛋白上連續(xù)的幾個(gè)氨基酸,也就是線性表位,那么這種抗體可同時(shí)用于免疫組化和Western blotting,而如果抗體識(shí)別構(gòu)象形表位,則只能用于免疫組化。一般抗體說明書上都有注明此種抗體識(shí)別的氨基酸區(qū)間。(限于單抗)

    Q4: 不能很好地將大分子量蛋白轉(zhuǎn)移到膜上, 轉(zhuǎn)移效率低怎么樣解決?

A4: 可以考慮:轉(zhuǎn)移緩沖液中加入20%甲醇(是指終濃度)(優(yōu)化的轉(zhuǎn)移緩沖液,可以參考《蛋白質(zhì)技術(shù)手冊》),因?yàn)榧状伎山档偷鞍踪|(zhì)洗脫效率,但可增加蛋白質(zhì)和NC膜的結(jié)合能力,甲醇可以防止凝膠變形,甲醇對高分子量蛋白質(zhì)可延長轉(zhuǎn)移時(shí)間;轉(zhuǎn)移緩沖液加入終濃度0.1%SDS,也是為了增加轉(zhuǎn)移效率;用優(yōu)質(zhì)的轉(zhuǎn)移膜,或使用小孔徑的NC膜(0.2微米);使用戊二醛交聯(lián);低濃度膠,如低至6%。太大時(shí)還可以考慮用瓊脂糖膠;提高轉(zhuǎn)移電壓/電流;增加轉(zhuǎn)移時(shí)間。

    Q5:Western blot哪種染色好?

A5: (1)陰離子染料是常用的,特別是氨基黑,脫色快,背景低檢測極限可達(dá)到 1.5μg,考馬斯亮藍(lán)雖然與氨基黑有相同的靈敏度,但脫色慢,背景高。麗春紅S和快綠在檢測后容易從蛋白質(zhì)中除去,以便進(jìn)行隨后的氨基酸分析。缺點(diǎn)是:溶劑系統(tǒng)的甲醇會(huì)引起硝化纖維素膜的皺縮或破壞,不能用于帶正電荷的膜。靈敏度低。

(2)膠體金,靈敏度高,檢測范圍可到pg級(jí),但染色比較穩(wěn)定。

3)生物素化靈敏度位于1、2之間,可用于任何一種膜。

    Q6: Western檢測基因轉(zhuǎn)染后細(xì)胞培養(yǎng)上清中表達(dá)的目的蛋白(定性),分子量為20KD,濃度約為幾百ng/ml。蛋白樣品是否需濃縮、純化?如何濃縮、純化上清液中的目的蛋白?對小分子蛋白Western blot時(shí)需特別注意哪些條件?

A6:按照提供的濃度,如果做Western blot,是不用濃縮樣品的. 對于20kd的小分子的蛋白,Western Blot中要注意的是:

    1、轉(zhuǎn)移時(shí)的時(shí)間,

    2、轉(zhuǎn)移時(shí)的電流或電壓.

    3、transfer buffer 中加20%的甲醇.

    4、可以用13-15%的分離膠.

    Q7: 半干法轉(zhuǎn)移與膠的面積和蛋白分子兩大小有一定關(guān)系,那么濕法轉(zhuǎn)移是不是所有的轉(zhuǎn)移條件都一樣呢?一般的條件是怎樣的?

A7:半干轉(zhuǎn)的電流大小是按照面積來算的,時(shí)間是根據(jù)蛋白分子大小定的;而濕轉(zhuǎn)的話電流是恒定的,時(shí)間也是根據(jù)分子量而定。

    Q8: 采用生物素標(biāo)記的二抗-SABC-DAB檢測系統(tǒng)做western,非特異性的條帶和背景很高,總蛋白考染的時(shí)候發(fā)現(xiàn)接近積層膠的條帶比較清楚,條帶也很窄,可是越靠下面的條帶越來越寬,有的跑得都連在一起,這是什么原因,如何解決?SDS—PAGE的時(shí)候恒壓和恒流哪個(gè)好?

A8:非特異性的條帶和背景高:可能性很多,如一抗,二抗,封閉的原因都可能??偟鞍卓既镜臅r(shí)候發(fā)現(xiàn)接近積層膠的條帶比較清楚,條帶也很窄,可是越靠下面的條帶越來越寬,有的跑得都連在一起,這種現(xiàn)象是正常的。另外,也可能積層膠有問題。SDS—PAGE的時(shí)候,恒壓和恒流都可以用。

    Q9: 血清樣品進(jìn)行Western blot 分析,目的蛋白21kD,結(jié)果顯色出來后,目的條帶很淡,而白蛋白和IgG條帶很濃,為什么?

A9:可能是因?yàn)榘椎鞍诪?/span>67kD和目的蛋白相差較大,且其濃度較低,可以底物二氨基聯(lián)苯胺和0.01%過氧化氫溶液顯色的時(shí)間延長為30分鐘,再用去離子水漂洗以終止反應(yīng);也可能是抗體的特異性不好。把封閉的時(shí)間延長,同時(shí)提高封閉液的濃度,可以減少以下背景噪音。同時(shí)洗的時(shí)候要*,而目的條帶弱,說明濃度不足,如果不考慮后續(xù)功能的話,可過G-50(細(xì))柱子,純化靶蛋白,接著真空冷凍濃縮,可以得到很好的結(jié)果。

    Q10: Western轉(zhuǎn)膜已經(jīng)成功了,但是Marker泳道未見蛋白條帶,其余各泳道均有清晰的蛋白條帶,經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染膠,結(jié)果相同。經(jīng)5%的脫脂牛奶封閉1小時(shí)45分鐘后,進(jìn)行一抗孵育(1200,建議起始濃度)過夜,二抗孵育5個(gè)半小時(shí)(1:2000),均在室溫下,DAB顯色,雖出現(xiàn)蛋白條帶,但較弱,且出現(xiàn)非特異性條帶。所用Marker可分離14-116KD的蛋白,是否因?yàn)?/span>marker有問題?一抗(多克隆抗體)、二抗的濃度及孵育的時(shí)間是否合適?封閉的時(shí)間是否太短?

A101. marker有可能被降解,也有可能是上樣量太少。

     2. 建議一抗4℃孵育過夜,稀釋比為1:100;如室溫孵育,兩小時(shí)即可。

     3. 二抗室溫1小時(shí),1:2000,或 4℃封閉過夜(室溫兩小時(shí)就夠),一抗室溫1小時(shí),二抗室溫1小時(shí),最好是一抗4℃過夜(或室溫2小時(shí))1:200,二抗室溫1小時(shí)1:2000,換ECL法。

  


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