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威尼德分子雜交儀:Western 中NC膜、PVDF膜、尼龍膜的差別

來源:威尼德生物科技(北京)有限公司   2022年07月23日 10:48  

       硝酸纖維素膜(nitrocellulose filter membrane,簡稱NC)NC膜在Northern Blot、Southern BlotWestern Blot中都需要用到,雜交技術有固相雜交和液相雜交之分。固相雜交技術目前較為常用,先將待測核酸結合到一定的固相支持物上,再與液相中的標記探針進行雜交。固相支持物常用硝酸纖維素膜。


PVDF膜即聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride)是蛋白質(zhì)印跡法中常用的一種固相支持物。PVDF膜是疏水性的,膜孔徑有大有小,隨著膜孔徑的不斷減小。膜對低分子量的蛋白結合就越牢固。大于20000的蛋白選用0.45um的膜,小于20000的蛋白選用0.2um的膜。PVDF膜使用是需預處理,用甲醇處理的目的是活化膜上的正電基團,使其更容易與帶負電的蛋白結合。PVDF膜具有較高的機械強度,是印跡法中的理想固相支持物材料。

尼龍膜是一種合成的長鏈聚酰胺薄膜,對核酸和蛋白質(zhì)具有很強的結合能力,能代替硝酸纖維素薄膜用于分子印跡和雜交實驗。NC膜、PVDF膜、尼龍膜的差別:尼龍膜是較理想的核酸固相支持物,有多種類型;硝酸纖維素膜是目前應用廣的一種固相支持物,價格便宜;PVDF膜介于二者之間。

1. 就結合能力而言:

尼龍膜結合DNARNA能力可達480600μg/cm2,可結合短至10bp的核酸片段;硝酸纖維素膜結合DNARNA能力可達80100μg/cm2,對于200bp的核酸片段結合能力不強;PVDF膜結合DNARNA能力可達125300μg/cm2。

2. 就溫度適應性而言:

尼龍膜經(jīng)烘烤或紫外線照射后,核酸中的部分嘧啶堿基可與膜上的正電荷結合;硝酸纖維素膜依靠疏水性相互作用結合DNA,結合不牢固;PVDF膜結合牢固,耐高溫,特別適合于蛋白印跡。就韌性而言:尼龍膜較強;硝酸纖維素膜脆,易破碎;PVDF膜較強。

3. 就重復性而言:

1)尼龍膜可反復用于分子雜交,雜交后,探針分子可經(jīng)堿變性被洗脫下來;硝酸纖維素膜不能重復使用;PVDF膜可以重復使用。

2NC膜的使用也很簡便,比如不需要甲醛預處理,只要在無離子水面浸潤排出膜內(nèi)氣泡,再在電泳緩沖液中平衡幾分鐘就可以了;比如NC膜很容易封閉,也不需要特別嚴謹?shù)那逑礂l件。轉移到NC膜上的蛋白在合適的條件下可以穩(wěn)定保存很長時間,不過要注意的是純的硝纖膜在比較脆,又容易卷,操作要小心,不適合用于需要多次重復清洗的用途。因為經(jīng)不起多次折磨。選擇硝纖膜時要注意的是選擇合適的孔徑,通常20KD以上的大分子蛋白用0.45um孔徑的膜,小于20KD的話建議選擇0.2um的,如果小于7KD的話最好選擇0.1um的膜。另外還要注意選擇純的NC膜混有含醋酸纖維(CM)NC膜結合力會有所降低。

3)由于NC膜上結合的蛋白會因為一些去污劑而被代替,因此在封閉時最好使用較溫和的Tween20,而且濃度不要超過0.3%(據(jù)說0.05%效果好)。一般而言,NC膜越純,其蛋白結合能力就越高,所以要增加WB的靈敏度和分辨率,提高所使用膜的純度是個可以考慮的選擇。如果NC膜攙雜一些醋化纖維素這在前面已經(jīng)提到,會影響蛋白質(zhì)結合。

4)與 纖維素膜相比,PVDF膜在蛋白質(zhì)截留能力,機械強度和化學相容性上都更*的性能。市售硝酸纖維素膜的典型結合量是80-100μg/cm2,PVDF膜結合量是100-200μg/cm2(而結合強度PVDF比硝纖膜強6倍!)。但是PVDF膜最大的優(yōu)點不僅于此:更好的機械強度和化學耐受性使PVDF膜在各種染色應用和多重免疫檢測中成為理想選擇;而且單個凝膠的泳道復本可用于多種目的,特別是需要做N端蛋白測序,在相當嚴酷的清洗條件下,當尼龍或者硝纖膜已經(jīng)降解的情況下PVDF膜依然保持本色,所以PVDF也是要做蛋白測序的選擇。但不適合熒光。PVDF膜特別注意的是需要100%甲醇預處理(不超過15)再用緩沖液平衡,才能用。

 


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