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高效液相（HPLC）色譜柱五大誤解

來源：大連凱美化工工程配套有限公司 2022年07月26日 15:41

使用填充較小顆粒的色譜柱，總能獲得更高的效率

假。盡管對于填充良好的色譜柱，隨著填充色譜柱中顆粒平均直徑的減小，效率會提高，但如果柱外對特定HPLC硬件系統(tǒng)的譜帶擴寬的貢獻足夠高，則該色譜柱的全部性能將無法獲得被實現(xiàn)。柱外成分包括填料本身以外的所有其他體積。這些貢獻包括以下內(nèi)容：

進樣量包括回路尺寸以及進樣閥內(nèi)的其他體積。
從進樣器出口到色譜柱入口的油管容積。
保護柱間隙的體積，包括端接頭（如果有）。
在線過濾器體積（如果有）。
入口色譜柱接頭內(nèi)的內(nèi)部容積包括多孔篩板和流動通道。
色譜柱的體積。
底部色譜柱接頭內(nèi)的內(nèi)部容積包括多孔篩板和流動通道。
從色譜柱出口到檢測器入口的油管容積。
流通池之前的檢測器內(nèi)的管道容積。
流通池體積。

所有這些體積的方差都是累加的。因此，可以程度地減少進樣量并使色譜柱入口管的長度短，內(nèi)徑小，但如果從色譜柱出口到檢測器的連接管有1 m，則譜帶展寬可能足夠大影響分離的整體效率。因此，如果您希望獲得1.8 μm HPLC色譜柱或內(nèi)徑為1.0 mm的色譜柱的預期效率，請確保將柱外效應(yīng)降至低。

誤解2

對于硅膠填料，殘留的硅烷醇導致拖尾峰

假。在某些情況下，存在于所有基于硅膠的鍵合相色譜柱上的硅烷醇會引起拖尾，特別是對于堿性化合物而言。這種拖尾歸因于硅烷醇基團是一種弱酸，pKa約為4.5-4.7。因此，當流動相的pH值接近4-5時，硅烷醇被離子化，并可以通過靜電吸引作用與帶正電的分子（如質(zhì)子化的胺）相互作用。通過將pH值降至3以下來抑制硅烷醇的離子化，可以大程度地減少這種相互作用。對于某些堿性化合物，有時在較低的pH值下會出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象。有專門設(shè)計的反相填料，可以為堿性化合物提供良好的峰形。

峰拖尾的三個基本原因：化學問題（其中一個已在前面討論過）；色譜柱填充問題和儀器硬件問題。這三個因素都可能導致峰拖尾，并且必須調(diào)查根本原因以確定補救措施。詳細討論這三個問題不在此問題的范圍內(nèi)，但是每種類型的一些示例將為您提供總體思路。首先，除了與硅烷醇的相互作用外，與化學有關(guān)的拖尾問題還可以通過幾種方式表現(xiàn)出來。金屬螯合化合物可與色譜柱填充物中的微量金屬發(fā)生相互作用，這對于較舊的二氧化硅材料尤為明顯。使用錯誤的注射溶劑有時會導致拖尾。用比流動相強得多的溶劑注入樣品會產(chǎn)生峰形失真。拖尾可能是由于色譜柱頂部強烈保留的樣品組分或流動相雜質(zhì)造成的堆積材料引起的。這種材料可以充當不同的固定相，從而導致相互作用的化合物出現(xiàn)拖尾問題。有時會出現(xiàn)混合模式，從而導致拖尾。在這里，溶質(zhì)可以通過反相和離子相互作用與活性基團相互作用。有時，當流動相的pH值錯誤并且樣品被部分電離時，所產(chǎn)生的峰可能會失真并且類似于拖尾。較大峰背面的部分共溶峰較小，有時看起來像拖尾。

色譜柱填充問題可能導致峰拖尾。色譜柱頂部的空隙會導致雙峰或峰拖尾。填料不充分的色譜柱可能會形成通道，導致峰形變差。如果色譜柱因樣品質(zhì)量過大而超載，則可能會出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，盡管峰前沿更為普遍。在低進樣質(zhì)量下，硅烷醇超載可能發(fā)生拖尾。

讓我們考慮一些可能會拖尾的儀器和硬件問題。拖尾可能是由柱外效應(yīng)和流路中其他未清掃的體積引起的。末端接頭或連接不正確造成的未清除體積可能會顯示為峰拖尾。來自進樣器的壓力脈沖可能會導致色譜柱空隙，從而導致拖尾。緩慢的檢測器時間常數(shù)和快速洗脫的峰會導致峰展寬，有時類似于拖尾。在室溫下進入的溶劑與較高的色譜柱操作溫度之間的熱不匹配也會導致峰變形。

因此，并非總是硅烷醇在HPLC中引起峰拖尾。

誤解3

硅膠填料只能在pH2-7范圍內(nèi)使用

假。通常，HPLC反相色譜柱的化學降解機理有兩種：pH值小于2時硅氧烷鍵的催化水解；液相色譜法。pH值大于7-8的氫氧根離子可溶解硅膠。這兩種現(xiàn)象已由Kirkland及其同事進行了廣泛研究。在pH值小于2時，–Si-O-Si-（硅氧烷）鍵可被氫鍵（H3O +）裂解鍵合相攻擊，從而導致在有機的損失。隨著時間的流逝，保留率通常會隨著碳含量的降低而降低。對于短鏈封端部分，例如三甲基硅烷，尤其值得注意。較長的C18相由于其空間位阻而對下面的硅氧烷提供了一定的保護，但最終甚至會受到侵蝕，尤其是在溫度高于環(huán)境溫度的情況下。有空間保護和緊密覆蓋的鍵合相，可幫助阻止鍵合相在硅膠上的裂解。聚合物相沒有顯示出這種不穩(wěn)定性，但是具有比基于二氧化硅的相效率低的缺點。

在高pH值方面，必須有某種方法來阻止下面的硅膠受到氫氧根離子的侵蝕。一旦發(fā)生溶解過程，色譜柱最終將失效，經(jīng)常會形成空隙。特殊色譜柱專為高pH操作而設(shè)計，包括二齒C18，雜化和聚合物涂層二氧化硅。這些相從化學上保護基礎(chǔ)材料免受氫氧化物的侵蝕。這些填料能夠承受11–12范圍內(nèi)的pH值。在此范圍內(nèi)操作時，大多數(shù)二氧化硅基填料應(yīng)避免高溫。當然，聚合物相可以在高達13的pH值下操作，有時甚至達到14，但是，它們的缺點是效率低于二氧化硅基相。

因此，真正的答案是：特殊的硅膠鍵合相可以在pH值為2–7的區(qū)間之外操作，但應(yīng)注意使用常規(guī)的硅膠填料，尤其是在高溫下。

納譜分析

ChromCore系列液相色譜柱參數(shù)信息表

誤解4

現(xiàn)代HPLC色譜柱應(yīng)承受至少1000次進樣

假！有許多因素可控制任何現(xiàn)代HPLC色譜柱可以承受的進樣次數(shù)。

一些因素基于模式：反相、離子交換、體積排阻、正相、手性、親水性相互作用等。

其中一些因素取決于色譜柱中填料的類型，例如硅膠填料、雜化填料、氧化鋯填料或聚合物填料，或軟凝膠或樹脂的交聯(lián)度。

一些因素取決于鍵合相本身：覆蓋范圍、鍵的類型、聚合物相、單層或涂層相。

其他因素取決于操作條件：pH、溫度、流動相成分、緩沖液組成、流速、壓力等。

還取決于所注入的樣品：僅標準樣品、樣品清潔度、樣品pH值、樣品體積、樣品中存在的雜質(zhì)、溶質(zhì)分子本身等。

如果濫用色譜柱，例如在超出其建議的pH限制或流速范圍內(nèi)使用色譜柱，則可能只會進樣50次甚至更少。如果樣品簡單，沒有高度保留的雜質(zhì)，則色譜柱可承受5000次或更多次進樣。如果色譜柱未在其上限處連續(xù)運行，則使用壽命會更長。如果色譜柱受到各種樣品的影響，并且從未沖洗過以去除強烈保留的雜質(zhì)，那么它將縮短其壽命。

大多數(shù)人期望當5 μm反相色譜柱用于分析配方，簡單藥物混合物和標準品時，至少要進樣1000次。如果該色譜柱用于“臟樣品”，例如尚未*清除的生物液體提取物或環(huán)境提取物，則不應(yīng)期望進行1000次進樣。

因此，預期的進樣次數(shù)不是固定的，而是取決于色譜柱的類型、操作條件、樣品清潔度和濫用程度。當然，對于使用保護柱和在線過濾器，色譜柱壽命應(yīng)更長。許多色譜分析人員實際上并不知道每根色譜柱的使用壽命可獲得多少次進樣。一些現(xiàn)代的HPLC儀器具有內(nèi)置的色譜柱模塊和軟件，可以使它們監(jiān)測進樣次數(shù)。

誤解5

色譜柱應(yīng)始終蓋緊，以防止填料與大氣接觸

而損壞

假！通常，端接件上的小孔的直徑可能不大于0.02英寸，其橫截面面積很小，以至于空氣進入填料和溶劑內(nèi)部的溶劑接觸會損壞色譜柱。色譜柱蒸發(fā)極少。即使有少量空氣進入色譜柱，也可能很難擴散通過微粒填充床并與足夠的填充材料接觸，從而產(chǎn)生不利影響。如果色譜柱中有少量空氣，則在下次將其安裝到HPLC儀器中并對其進行泵送流動相后立即對其加壓，則少量的空氣可能會在高壓下溶解或被沖洗掉。初始液體在短時間內(nèi)不會對以后的使用造成任何問題。但是，如果一定要通過封住端接裝置而感到更加安全，那就這樣做。大多數(shù)色譜柱配備了色譜柱接頭，可以擰緊這些螺帽，以防止存儲溶劑蒸發(fā)或空氣進入填充床的任何可能性。

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