DNA甲基化（DNA methylation）是指在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶（DNMT）催化下，以S-腺苷甲硫氨酸為甲基供體，將活性甲基轉(zhuǎn)移至DNA鏈中特定堿基上的化學(xué)修飾過程。哺乳動(dòng)物基因組中，DNA甲基化多發(fā)生在CpG二核苷酸中的胞嘧啶的5位碳原子。DNA甲基化是一種表觀（epigenetic）修飾，它在不改變DNA序列的情況下，對(duì)個(gè)體的生長(zhǎng)、發(fā)育、基因表達(dá)模式以及基因組的穩(wěn)定性起到重要的調(diào)控作用，并且這種修飾在發(fā)育和細(xì)胞增殖的過程中是可以穩(wěn)定傳遞的。

既然DNA異常甲基化與腫瘤發(fā)生相關(guān)，那我們常使用的研究方法是什么呢？對(duì)于檢測(cè)特定基因的甲基化，常用的就是是重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化&克隆測(cè)序(Bisulfite Cloning & Sequencing)。首先針對(duì)特定的區(qū)域設(shè)計(jì)引物，隨后用限制性內(nèi)切酶消化基因組DNA，接著用重亞硫酸鹽處理，PCR，挑克隆測(cè)序。

當(dāng)然在使用重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化&克隆測(cè)序的方法對(duì)特定基因研究過程中也會(huì)碰到一些問題，那么小海星就為大家梳理一些常見問題的應(yīng)對(duì)措施以及注意事項(xiàng)。

首先我們知道亞硫酸氫鈉修飾DNA的目的是將DNA序列中未甲基化的胞嘧啶*轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，而甲基化的5-甲基胞嘧啶保持不變。因而影響此過程的主要因素有修飾試劑的濃度、反應(yīng)溫度、反應(yīng)環(huán)境的pH值及反應(yīng)時(shí)間。其中任何一個(gè)環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題都將導(dǎo)致MSP擴(kuò)增失敗。

可能的原因如下：

(1)亞硫酸氫鈉的濃度控制在3．0～3．9 mol/L為好，其pH值必須用NaOH精確調(diào)整至5.0；

(2)修飾時(shí)間應(yīng)掌握在10～16 h，修飾時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致甲基化胞嘧啶也會(huì)轉(zhuǎn)化成尿嘧啶且DNA模板破壞加劇，而時(shí)間過短會(huì)導(dǎo)致修飾不*；

3)反應(yīng)溫度應(yīng)控制在50～55℃(若用國(guó)產(chǎn)恒溫水浴箱建議溫度設(shè)定在53℃為好)；

4)DNA模板量應(yīng)控制在<2ug為宜。  

只要遵循以上幾點(diǎn)基本上能保證99％ 未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不變。但是，此修飾過程中模板DNA有約96％已經(jīng)降解 。

Hycyte™甲基化檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品，基于腫瘤早篩熱門靶點(diǎn)，研發(fā)低甲基化水平的陰性對(duì)照品和高甲基化水平的陽(yáng)性對(duì)照品，適用于重亞硫酸鹽測(cè)序法（Bisulfite Sequencing）、甲基化熒光PCR法（MethyLight）、甲基化特異性PCR（MS-PCR）、焦磷酸測(cè)序等多種平臺(tái)的性能評(píng)估。樣本來(lái)源于人類細(xì)胞系，接近患者樣本。覆蓋多種癌癥有關(guān)變異位點(diǎn)，包含結(jié)直腸癌、胃癌、肺癌、宮頸癌等。