做蛋白研究的小伙伴都知道，一個完整的Western Blot包括了很多個步驟，從蛋白提取到配膠、上樣電泳，再到轉膜、封閉，后孵育一抗二抗后才能去進行檢測。時間跨度非常長，而且這中間的每一步都包含了很多的小細節(jié)，稍有不慎就會導致結果出錯，然后又得從頭來過。所以，關于WB，幾乎每一位經(jīng)驗豐富的實驗老手都有著一本厚厚的血淚史。

今天，小編就帶領大家簡要梳理一遍WB流程中的一些細節(jié)，避免因某一環(huán)節(jié)出現(xiàn)差錯而導致實驗重做。

Western Blot概述

Western Blot采用的是變性聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離蛋白質混合物，經(jīng)過SDS-PAGE分離的蛋白質被到轉移到固相支撐物（NC膜，PVDF膜等）上后，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質，且能保持膜上蛋白質或多肽的抗原性質不變，以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原，與其對應的抗體發(fā)生免疫反應，一抗再與酶標記的二抗體起反應，經(jīng)過底物顯色以檢測特異蛋白質表達水平。

由于Western blot技術服務具有簡便，快捷等特點，所以目前該技術也被廣泛應用于蛋白質表達水平的檢測。

一：樣品的獲取與制備

一般來說我們檢測的樣品主要為細胞或者是組織，制備過程中盡量保持低溫。其次在制備時一定要根據(jù)目的蛋白的特性選擇合適的裂解液，比如對膜蛋白的提取、胞漿蛋白的提取和組織蛋白的提取等。

二：配膠、上樣及蛋白電泳

配置凝膠時一定要將膠板清洗干凈，用ddH2O或者無水乙醇潤洗。晾干后根據(jù)蛋白分子量進行不同濃度凝膠配制。上樣時需對蛋白進行煮沸變性，如果進行定量分析一定要將所有蛋白上樣量調至相同。電泳時低壓（80V）跑濃縮膠，高壓（120v）跑分離膠，至溴酚藍即將跑出膠面時終止電泳。

三：轉膜及封閉

轉膜時需提前配置好轉膜液并低溫放置。關于印跡膜來說，目前大多實驗室用的是PVDF膜，根據(jù)目的蛋白大小選擇合適的孔徑，大于20KDa的蛋白選用0.45μm的膜，小于20KDa的蛋白選用0.2μm的膜。PVDF膜在使用時需用甲醇處理活化膜上的正電基團，使其更容易與帶負電的蛋白結合。轉膜時一定要注意膜和凝膠的正反問題，除此之外一定要注意凝膠和轉印膜間不要留有氣泡。封閉液可選擇5%的BSA或5%的脫脂奶粉，可以室溫封閉1-2h或者4℃過夜封閉。封閉時一定要注意對磷酸化的抗體或生物素標記的抗體不能用脫脂奶粉封閉膜，只能用5% BSA。

四：抗體的孵育和檢測

一抗二抗的選擇一定要注意種屬來源問題，如果這一步出錯那前面的努力就相當于白費了。檢測方法可以選擇靈敏度超高的化學發(fā)光方法或者現(xiàn)在比較流行的熒光WB法。相較于傳統(tǒng)的化學發(fā)光方法，熒光WB能夠實現(xiàn)更精-準的定量，還可以進行多重檢測，只需要將不同的目的蛋白標記上不同的熒光就可以了。基于目前各大期刊雜志對WB發(fā)表的要求，全蛋白定量是一種新的趨勢，熒光WB同樣可以實現(xiàn)全蛋白歸一化。