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辣根過氧化物酶（Horseradish Peroxidase,HRP）比活性高，穩(wěn)定，分子量小，純酶容易制備，所以最.常用。HRP廣泛分布于植物界，辣根中含量高，它是由無色的酶蛋白和棕色的鐵卟啉結(jié)合而成的糖蛋白，糖含量18%。HRP由多個(gè)同工酶組成，分子量為40,000，等電點(diǎn)為pH3～9，酶催化的最適pH因供氫體不同而稍有差異，但多在pH5左右。酶溶于水和58%以下飽和度硫酸銨溶液。HRP的輔基和酶蛋白最大吸收光譜分別為403nm和275nm，一般以O(shè)D403nm /OD275nm的比值RZ（德文Reinheit Zahl）表示酶的純度。高純度的酶RZ值應(yīng)在3.0左右（最高可達(dá)3.4）。RZ值越小，非酶蛋白就越多。
用途
（1） RZ＞3 活性 ＞250u/mg， 主要應(yīng)用于免疫學(xué)，是高純度的過氧化酶。采用特殊色譜純化技術(shù)以除去會(huì)影響免疫學(xué)反應(yīng)的同工酶B .
（2） RZ＞2 活性 ＞180u/mg ，主要應(yīng)用于臨床化學(xué)，我們的客戶也有將這個(gè)規(guī)格的產(chǎn)品應(yīng)用于免疫學(xué)研究的。此時(shí)，一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化的分析方法就變得尤為重要。
（3） RZ＞1 活性 ＞100u/mg，主要應(yīng)用于血糖試紙和尿液分析試紙。
（4） RZ＞0.6 活性 ＞60u/mg ，主要應(yīng)用于尿液分析試紙。
制備
實(shí)驗(yàn)原理
過氧化物酶催化以下反應(yīng)：
2 H2O2 →O2+2H2O
這一類酶以鐵卟啉為輔基，所以屬血紅素蛋白質(zhì)類（hemeProteins）。過氧化物酶在生物界分布極廣，在細(xì)胞代謝的氧化還原過程中起重要的作用。
本實(shí)驗(yàn)是以辣根為原料，經(jīng)過水的抽提，硫酸銨和丙酮分級(jí)分離，再經(jīng)鋅離子純化，透析除鹽，冷凍干燥，最后制得高純度的辣根過氧化物酶。
辣根過氧化物酶分子量在40,000左右，是一種含亞鐵血紅素的蛋白質(zhì)，等電點(diǎn)7.2；易溶于水，溶解度為5%（W/V），溶液呈棕紅色，透明；也溶于0.58飽和度以下的硫酸銨溶液，而0.62飽和度以上則不溶。該酶最適pH為7.0（對(duì)愈創(chuàng)木酚為氫給體而言）。在室溫下HRP在幾周內(nèi)保持穩(wěn)定，加熱到63℃后15分鐘內(nèi)穩(wěn)定。
辣根過氧化物酶氧化還原電勢(shì)很低，pH6.08時(shí)，E’0= -0.2070V；pH為7.71時(shí)，E’0= -0.5787V。
辣根過氧化物酶的作用機(jī)理可分以下幾步：
第一步，形成綠色有活性的酶一底物復(fù)合物Ⅰ：第二步，復(fù)合物Ⅰ轉(zhuǎn)變成紅色有活性的復(fù)合物Ⅱ：
復(fù)合物Ⅰ+AH→復(fù)合物Ⅱ+A
第三步，復(fù)合物Ⅱ被還原，釋放出酶：AH：表示還原型氫供體。
在一定程度上復(fù)合物Ⅱ可自發(fā)地分解成HRP和產(chǎn)物（P），亦可與過量的過氧化氫形成無活性的復(fù)合物Ⅲ。
辣根過氧化物酶的活力測(cè)定方法有多種，主要原理介紹如下：
1、Rz值，提純工作的后幾步以及純酶溶液可用Rz值表明酶的純度
403nm處的吸收代表血紅素輔基的吸收，275nm的吸收是蛋白質(zhì)的吸收，結(jié)晶的HRP的Rz值為3.04。測(cè)定時(shí)的酶濃度為1毫克蛋白/毫升。
2、愈創(chuàng)木酚法：測(cè)k4[見反應(yīng)式⑶]。以愈創(chuàng)木酚（鄰甲氧基酚，guaiacol）為氫給體，其反應(yīng)如下：
四鄰甲氧基連酚有色產(chǎn)物四鄰甲氧基連酚（E470nm = 26.6mM－1·cm－1）生成的速度（dx/dt）與底物過氧化氫以及氫供體愈創(chuàng)木酚的濃度有關(guān)。方程如下：
e—酶濃度；
α0—?dú)涔w起始濃度；
x0為過氧化氫的起始濃度。
如果測(cè)定的條件選擇成k4α0＞＞k1x0，可以測(cè)得k1：
所
—測(cè)定過程中底物減少的速度。
本實(shí)驗(yàn)是采用測(cè)定k4的方法來判斷酶的純度。
上述測(cè)定Rz值和k4值的方法雖然比較簡(jiǎn)單，但都不能測(cè)得酶的實(shí)際活力單位。測(cè)定過氧化物酶的傳統(tǒng)方法是連苯三酚試驗(yàn)法，以過氧化氫為底物，在酶作用下，連苯三酚可形成紅棓酚（Purpurogallin），在430nm處測(cè)定產(chǎn)物的形成。用紅棓酚值（PZ）表示酶的活力。PZ表示在標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定條件下1毫克酶所形成的紅棓酚微克數(shù)。
儀器和試劑
儀器
離心機(jī)、干燥器、分光光度計(jì)。
試劑
⒈ 硫酸銨：工業(yè)純和化學(xué)純；
⒉ 丙酮。
⒊ 10mM pH7.0磷酸鹽緩沖液：稱取243.5毫克磷酸二氫鈉（NaH2PO4·2H2O）和857毫克磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O），溶于400毫升水中。
⒋ 20mM愈創(chuàng)木酚溶液：取0.22毫升愈創(chuàng)木酚加水至100毫升。
⒌ 40mM過氧化氫溶液：取0.4毫升30%過氧化氫加水至100毫升（如測(cè)k1則用10mM過氧化氫溶液）。臨用前配制。
⒍ 5%乙酸鋇溶液
⒎ 奈氏試劑
⒏ 0.1 mol/L硝酸銀溶液
操作步驟
（一）HRP的制備
⒈水提?。?/div>
稱取 10斤用水沖刷干凈的鮮辣根（辣根皮中亦含有豐富的HRP），用菜刀切成小碎塊，在攪肉機(jī)中攪碎1~2次。碎渣漿用1倍體積的水在低溫下攪拌提取過夜（亦可采用高速抽提法）。次日用甩干機(jī)（或離心機(jī)）甩干，收集濾液，碎渣再用1/4倍體積水浸泡提取一次，合并兩次濾液，量總體積和度，0。
⒉硫酸銨分級(jí)分離：
在不斷攪拌下，每升濾液中慢慢加入226克硫酸銨粉末（相當(dāng)于0.40飽和度），大約在1~2小時(shí)內(nèi)加完，置冷室中放置過夜。次日將上清液小心地用虹吸管移出，下面渾濁液以3000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，棄沉淀，合并上清液。再按每升上清液加258克硫酸銨粉末（0.8飽和度）隨加隨攪拌，當(dāng)硫酸銨全部溶解后，置冷室過夜。次日，虹吸出上清液，沉淀部分在冰凍離心機(jī)中以13000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘，棄去上清液，收集沉淀。將沉淀懸浮于100~150毫升蒸餾水中（加水量要使沉淀全部溶解為止），分裝于透析袋內(nèi)，放在流動(dòng)自來水中進(jìn)行透析1~2天，直到硫酸銨透析完畢為止（可用5%乙酸鋇溶液或奈氏試劑進(jìn)行檢查）。然后改換成用蒸餾水透析，中間更換2~3次，用0.1 mol/L硝酸銀溶液檢查透析外液無氯離子為止。
將透析液合并，在冰凍離心機(jī)中以 4000轉(zhuǎn)/分離心 15分鐘；去沉淀，量上清液的體積。
⒊丙酮分級(jí)分離：
將上清液倒入燒杯并置冰鹽浴中，在不斷攪拌下，用細(xì)滴管沿杯壁加入1倍體積預(yù)冷至-15℃的丙酮，放置片刻，在冰凍離心機(jī)中以4，000/分離心15分鐘，棄去沉淀。上清液再加入0.8體積（按原上清液體積）-15℃丙酮，（操作同上），靜置后，在冰凍離心機(jī)中離心收集沉淀。將沉淀溶于少量蒸餾水中，透析除丙酮?？傻肦z值近于1的酶溶液。
⒋精制：
將上步酶液適當(dāng)稀釋，滴加1M硫酸鋅溶液，使酶液中鋅離子濃度為10-3M，5000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，得上清液。再將沉淀用少量蒸餾水洗滌，離心，洗液與清液合并，分裝于透析袋內(nèi)，對(duì)水透析除鹽，用微孔濾膜過濾，進(jìn)行真空冷凍干燥（約得20毫克），產(chǎn)品呈米黃色纖維狀松軟物，HRP產(chǎn)品的Rz值可達(dá)3.0左右，置真空干燥器中低溫保存。
（二）HRP的活力測(cè)定
⒈活力測(cè)定：測(cè)定k4值的方法操作如下：
取2個(gè)比色池（帶蓋，光程1厘米），按下表加入反應(yīng)物
*酶液：將1毫克蛋白/毫升的酶液用磷酸鹽緩沖液稀釋10倍后應(yīng)用。
加好反應(yīng)物，搖勻，在470nm 讀出OD值，為t=0 的讀數(shù)。立即加0.01毫升40mM過氧化氫溶液于2個(gè)比色池中，即刻搖勻并記時(shí)，每隔30秒鐘讀數(shù)一次，約5分鐘。并記下實(shí)驗(yàn)時(shí)的室溫。
將所測(cè)樣品的OD值減去相應(yīng)時(shí)間對(duì)照的OD值，然后以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，時(shí)間為橫坐標(biāo)作圖。得一直線，計(jì)算出平均每分鐘光密度的增加值，即求出△x/△t，按公式⑻求出k4值。實(shí)際的實(shí)驗(yàn)值k4 = 2.2×10，k4 = 3.1×10，而k4 應(yīng)當(dāng)為3.3×10。該方法用于測(cè)定粗的無細(xì)胞提取液誤差較大。
因?yàn)槟承┪镔|(zhì)可干擾四鄰甲氧基連酚的形成。
或不求k4值，而把在上述條件下，每分鐘OD470增加0.001所需酶量定為1個(gè)HRP活力單位。
⒉蛋白質(zhì)含量的測(cè)定：
將酶液適當(dāng)稀釋后，用 Folin一酚試劑法比色測(cè)定蛋白質(zhì)含量。
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