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基質(zhì)膠實驗應用——血管生成

來源：翌圣生物科技（上海）股份有限公司 2022年08月01日 10:46

血管生成（angiogenesis ）會與傷口愈合、炎癥、類風濕性關(guān)節(jié)炎、糖尿病視網(wǎng)膜病變、黃斑變性和腫瘤生長等存在著密切的關(guān)聯(lián)。在生物體生長過程中，血管生成是新組織生長的重要組成部分。在成年期，除在特殊器官中受到嚴格調(diào)節(jié)的周期性事件外，由于促血管生成和抗血管生成內(nèi)源性因素之間的平衡，幾乎每個正常組織都缺乏大量的生理性血管生成。當促血管生成方向的平衡被打亂時，微血管內(nèi)皮細胞 (EC) 會轉(zhuǎn)變?yōu)檠苌杀硇停瑥亩_始血管生成反應，該反應可以被消除或加速。

在研究過程中所涉及到血管生成實驗，傳統(tǒng)的體內(nèi)血管生成實驗方法有：角膜微袋、腸系膜、海綿/基質(zhì)植入物、圓盤分析 (DAS)、斑馬魚等。但這些實驗不僅技術(shù)要求高，成本昂貴，耗時長，還會涉及到道德倫理問題等。相較于體內(nèi)做血管生成實驗，在體外利用特殊基質(zhì)維持細胞生成血管是一種比較經(jīng)濟和實用的實驗[1]，其中的細胞生長維持基質(zhì)物就是來源與EHS小鼠腫瘤中提取出的可溶性基底膜制備物——基質(zhì)膠。

基質(zhì)膠主要成分由層粘連蛋白，Ⅳ型膠原，硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（HSPG）和巢蛋白等組成，還包含生長因子如TGF-beta、EGF、IGF、FGF、組織纖溶酶原激活物和EHS腫瘤自身含有的其他生長因子。為組織和細胞提供支撐、抗拉強度和支架支撐，也可以作為細胞粘附和運動的三維亞結(jié)構(gòu)以及生長因子、趨化因子和細胞因子的儲存庫，同時可作為細胞形態(tài)發(fā)生和分化的信號等。翌圣生物開發(fā)生產(chǎn)的CeturegelTM基質(zhì)膠不含LDEV（乳酸脫氫酶增高病毒），超低內(nèi)毒素含量，并全部經(jīng)過支原體檢測保證無支原體污染，包括基本濃度、高濃度、低生長因子等不同類型基質(zhì)膠。

應用方向

產(chǎn)品特點

安全性高：不含LDEV（乳酸脫氫酶增高病毒）

濃度多樣性：濃度范圍在8~20 mg/mL之間

批次穩(wěn)定性好：嚴格生產(chǎn)質(zhì)檢過程保證批次間性能穩(wěn)定

低內(nèi)毒素：內(nèi)毒素含量≤4 EU/mL

污染物檢測：經(jīng)檢測無支原體和細菌、真菌殘留

單批產(chǎn)量高：單批產(chǎn)量在L級別以上

兼容性好：可與任何類型的細胞培養(yǎng)基兼容

血管生成實驗

“

實驗步驟

基質(zhì)膠準備

實驗前一天，從冷凍冰箱內(nèi)取出CeturegelTM基質(zhì)膠并置于4℃冰箱過夜融化，同時對所使用的耗材預冷處理。
實驗前將CeturegelTM基質(zhì)膠始終放置在冰盒中。
打開血管生成載玻片滅菌包裝，取出載玻片。
向每孔內(nèi)加入10 μl CeturegelTM基質(zhì)膠，注意加入CeturegelTM基質(zhì)膠時槍頭要垂直于內(nèi)孔的正上方，防止有基質(zhì)膠流經(jīng)上孔而留下殘膠。

凝膠

首先蓋上載玻片的蓋子，準備一個10 cm的培養(yǎng)皿，放入浸過水的紙巾，制成一個濕盒。
將載玻片放入培養(yǎng)皿中，蓋上培養(yǎng)皿蓋。
將整個培養(yǎng)皿放入CO2培養(yǎng)箱中，靜置30min左右等待膠凝結(jié)，同時準備細胞懸液。

細胞鋪板

將消化后的細胞制備成密度為2*10⁵ cells/ml細胞懸液，充分混勻。
將含有已經(jīng)凝固成膠狀的血管載玻片取出。
每孔加入50μl的細胞懸液，注意保持槍頭垂直在上孔的上方，不要接觸下孔的凝膠。
加入細胞培養(yǎng)基，蓋上蓋，靜置，一段時間后，所有細胞都會沉下去落在基質(zhì)膠的表面。

圖像采集

按照細胞生長速度定時觀察拍照、留存圖像。

免疫熒光染色（選做）

小心移除孔內(nèi)培養(yǎng)基，切勿碰觸膠或者細胞網(wǎng)絡。用無血清培養(yǎng)基稀釋鈣黃綠素使其終濃度為6~8 µg/ml。
加入細胞染液使其*浸沒細胞，室溫，避光孵育30~40分鐘。
PBS清洗三次，注意PBS要緩緩加入上孔，以免沖擊掉細胞。
使用Ex=485 nm，Em=529 nm波長進行熒光觀察

結(jié)果統(tǒng)計

并對其成管長度、覆蓋面積、成環(huán)數(shù)、結(jié)點數(shù)進行測量和記錄，并進行統(tǒng)計分析。

圖：血管生成結(jié)果圖

圖：血管免疫熒光染色圖[2]

FAQ

01 拿到的基質(zhì)有色差的變化（淡黃色到深紅色）是什么原因？

對于含酚紅的基質(zhì)膠主要原因是由于酚紅和碳酸氫鹽與CO2作用引起的，但是與5％CO2平衡后色差即會減少。凍融后，輕輕搖晃試劑瓶使基質(zhì)膠分散均勻。

02 基質(zhì)膠的操作要注意哪些事項？

所有操作需在無菌環(huán)境下進行，應使用預冷的移液器以保證基質(zhì)膠呈勻漿狀。

03 基質(zhì)膠的如何分裝凍存使用？

可將凍融后的CeturegelTM基質(zhì)膠分裝在多個小管，所有分裝均需用預冷的凍存管，迅速冷凍并保存，避免多次凍融。所有涉及到使用的物品在使用前需預冷，使用預冷的移液管、吸頭及小管等操作基質(zhì)膠。

[1] Norrby K. In vivo models of angiogenesis. J Cell Mol Med. 2006 Jul-Sep;10(3):588-612. doi: 10.1111/j.1582-4934.2006.tb00423.x.

[2] Benton G, Arnaoutova I, George J, Kleinman HK, Koblinski J. Matrigel: from discovery and ECM mimicry to assays and models for cancer research. Adv Drug Deliv Rev. 2014 Dec 15;79-80:3-18. doi: 10.1016/j.addr.2014.06.005.

相關(guān)產(chǎn)品

產(chǎn)品類型	產(chǎn)品名稱	編號	規(guī)格
基本濃度	Ceturegel^TM Matrix LDEV-Free基質(zhì)膠	40183ES08/10	5/10 mL
基本濃度	Ceturegel^TM Matrix Phenol Red-Free，LDEV-Free 基質(zhì)膠	40184ES08/10	5/10 mL
低生長因子	Ceturegel^TM Matrix GFR，LDEV-Free 基質(zhì)膠	40185ES08/10	5/10 mL
低生長因子	Ceturegel^TM Matrix GFR， Phenol Red-Free，LDEV-Free 基質(zhì)膠	40186ES08/10	5/10 mL
高濃度	Ceturegel^TM Matrix High Concentration，LDEV-Free 基質(zhì)膠	40187ES08/10	5/10 mL
	Ceturegel^TM Matrix High Concentration，Phenol Red-Free，LDEV-Free 基質(zhì)膠	40188ES08/10	5/10 mL
	Ceturegel^TM Matrix High Concentration，GFR，LDEV-Free 基質(zhì)膠	40189ES08/10	5/10 mL
干細胞專用	Ceturegel^TM Matrix hESC-Qualified，LDEV-Free 基質(zhì)膠	40190ES08/10	5/10 mL
類器官專用	Ceturegel^TM Matrix for Organoid culture，Phenol Red-Free，LDEV-Free 基質(zhì)膠	40191ES08/10	5/10 mL

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