與 BMSCs 共培養(yǎng)可提高 ACCs 的軟骨分化

在常氧或缺氧條件下，在單一培養(yǎng)和與 BMSCs 共培養(yǎng)下測量 ACC 顆粒的大小和重量。如圖1所示，通過與 BMSCs 共培養(yǎng)，ACC 顆粒的尺寸（圖1 a）和重量（圖1 b）增加。此外，作為軟骨分化的主要參與者，發(fā)現(xiàn)在缺氧條件下與 BMSCs 共培養(yǎng)的 ACCs 中 S-GAG（硫酸化糖胺多糖）水平顯著升高（圖1 c）。此外，通過與 BMSCs 共培養(yǎng)，ACCs 的增殖速率顯著提高（圖1 d）。

圖1 sGAG 檢測表明，與 BMSCs 共培養(yǎng)可增強(qiáng) ACCs 的軟骨分化。

與 BMSCs 共培養(yǎng)的 ACCs 中 KDM6A 和 SOX9 的表達(dá)增加

定量 RT-PCR 和蛋白質(zhì)印跡分析 KDM6A 和 SOX9 的表達(dá)。缺氧條件下，KDM6A mRNA 在與 BMSCs 共培養(yǎng)的 ACCs 中顯著上調(diào)（圖2 a）。同樣，在缺氧下與 BMSCs 共培養(yǎng)，ACCs 中的 SOX9 mRNA 表達(dá)也升高（圖2 b）。蛋白質(zhì)印跡分析顯示 KDM6A 和 SOX9 的蛋白質(zhì)表達(dá)趨勢相似（圖2 c）。

圖2 定量實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 和蛋白質(zhì)印跡表明，在正常氧和缺氧條件下，KDM6A 和 SOX9 在與 BMSCs 共培養(yǎng)的 ACCs 中表達(dá)增加。

2型膠原蛋白和 Aggrecan mRNAs 在與 BMSCs 共培養(yǎng)的 ACCs 中的表達(dá)升高

此外，在常氧和缺氧下，在單一培養(yǎng) ACCs 和與 BMSCs 共培養(yǎng)的 ACCs 中評(píng)估了 2型膠原蛋白和 Aggrecan（軟骨蛋白聚糖）的 mRNA 表達(dá)。缺氧條件下，2型膠原蛋白（圖3 a）和 Aggrecan（圖3 b）的 mRNA 表達(dá)在與 BMSCs 共培養(yǎng)的 ACCs 中上調(diào)。

圖3 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 表明，在正常氧和缺氧條件下，與 BMSCs 共培養(yǎng)的 ACCs 中，2型膠原和 Aggrecan 的 mRNA 表達(dá)增強(qiáng)。

在與 BMSCs 共培養(yǎng)的 ACCs 中，SOX9 啟動(dòng)子的 DNA 甲基化降低

基因啟動(dòng)子中的 DNA 甲基化可以對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行負(fù)調(diào)節(jié)。如圖4 所示，進(jìn)行了亞硫酸氫鹽測序 PCR，以分析在各種條件下處理的 ACCs 中 SOX9 啟動(dòng)子的 DNA 甲基化狀態(tài)。缺氧條件下，與 BMSCs 共培養(yǎng)的 ACCs 中，SOX9 啟動(dòng)子的 DNA 甲基化顯著降低。

圖4 亞硫酸氫鹽測序PCR 表明，在正常氧和缺氧狀態(tài)下，與 BMSCs 共培養(yǎng)的 ACCs 中 SOX9 啟動(dòng)子的 DNA 甲基化降低。

與 BMSCs 共培養(yǎng)抑制了 ACCs 的凋亡

使用流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估 ACCs 在不同條件下的凋亡狀態(tài)。如圖5 所示，在缺氧狀態(tài)下與 BMSCs 共培養(yǎng)顯著抑制了 ACCs 的凋亡。這些結(jié)果表明，ACCs 和 BMSCs 的共培養(yǎng)顯著抑制了 ACCs 的凋亡。

圖5 流式細(xì)胞術(shù)表明，在正常氧和缺氧狀態(tài)下，與 BMSCs 共培養(yǎng)可降低 ACCs 的凋亡。

ACCs 與 BMSCs 共培養(yǎng)可減輕軟骨損傷

建立 OA 大鼠模型，并在正常和缺氧條件下 BMSCs 與 ACCs 共培養(yǎng)。對(duì) OA 大鼠模型軟骨病變進(jìn)行 Mankin 病理評(píng)分（骨性關(guān)節(jié)炎軟骨退變程度進(jìn)行評(píng)價(jià)的通用標(biāo)準(zhǔn)），發(fā)現(xiàn) OA 大鼠中顯示出顯著更高的 Mankin 評(píng)分。在缺氧下用 ACCs 與 BMSCs 共培養(yǎng)后，OA 大鼠的 Mankin 評(píng)分顯著降低（圖6）。

圖6 軟骨病變的 Mankin 分級(jí)表明，在正常氧和缺氧下，BMSCs 與 ACCs 共培養(yǎng)可減弱 OA 大鼠軟骨病變。

BMSCs 與 ACCs 共培養(yǎng)增加了 OA 大鼠 KDM6A 和 SOX9 的表達(dá)

使用 qPCR 檢查 KDM6A 和 SOX9 在 OA 大鼠中的 mRNA 表達(dá)。OA 大鼠 KDM6A 和 SOX9 的 mRNA 表達(dá)明顯被抑制，而在正常氧和缺氧下，ACCs 與 BMSCs 共培養(yǎng)的 OA 大鼠 KDM6A（圖7 a）和 SOX9（圖7 b）的表達(dá)顯著增加。此外，在不同條件下評(píng)估了 SOX9 啟動(dòng)子的 DNA 甲基化。OA 大鼠 SOX9 啟動(dòng)子的 DNA 甲基化逐漸增加，而在正常氧和缺氧下 ACCs 與 BMSC 共培養(yǎng)的 OA 大鼠中 SOX9 啟動(dòng)子的 DNA 甲基化降低（圖7 c）。

圖7 定量實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 和亞硫酸氫鹽測序 PCR 表明，與 BMSCs 共培養(yǎng)的 ACCs 處理增加了 OA 大鼠 KDM6A 和 SOX9 mRNA 的表達(dá)。

總之，該研究數(shù)據(jù)表明，缺氧通過促進(jìn) KDM6A 表達(dá)和激活 SOX9 信號(hào)通路來改善 BMSCs 的分化和增殖。這是 BMSCs 分化的一種新機(jī)制，為 OA 治療帶來了光明的前景。

參考文獻(xiàn)：Zhi Z, Zhang C, Kang J, Wang Y, Liu J, Wu F, Xu G. The therapeutic effect of bone marrow-derived mesenchymal stem cells on osteoarthritis is improved by the activation of the KDM6A/SOX9 signaling pathway caused by exposure to hypoxia. J Cell Physiol. 2020 Oct;235(10):7173-7182. doi: 10.1002/jcp.29615. Epub 2020 Feb 5. PMID: 32020624.

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