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三種凝膠法常用方法:試管法、玻片法及毛細(xì)吸管法的介紹

來源:科德角國際生物醫(yī)學(xué)科技(北京)有限公司   2022年08月09日 10:56  

凝膠法常用的方法有三種,即試管法、玻片法及毛細(xì)吸管法。



  1. 試管法

將等量的被檢樣品與試劑加入試管,混勻,放入水浴中讓其充分反應(yīng),然后取出觀察凝膠形成的情況。實(shí)驗(yàn)時(shí)共需作四種試管,即試驗(yàn)管、陽性對照管、陰性對照管及陰性抑制對照管。


試驗(yàn)管取標(biāo)本0.1ml+試劑0.1ml。般的標(biāo)本如水、注射液等,實(shí)驗(yàn)前不須加以處理,但血液及腹腔滲出液等實(shí)驗(yàn)前必須加以處理,因?yàn)樵谶@些標(biāo)本中可能會有LTLimulus test,鱟試劑法)反應(yīng)的抑制物質(zhì)。應(yīng)用的試劑應(yīng)事前以標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素進(jìn)行標(biāo)定,并認(rèn)為是可用的。


陽性對照管:標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素0.1ml+試劑0.1ml。標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素用前應(yīng)以WHO標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)定。所用的內(nèi)毒素濃度按試劑的敏感性而定,一般為15 ng/ ml。


陰性對照管:無熱原水0.1ml+試劑0.1ml


抑制對照管:標(biāo)本0.1ml+標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素0.1ml+試劑0.2ml。


上述四管均放入37℃孵育12小時(shí)觀察結(jié)果。如形成凝膠堅(jiān)固,試管倒轉(zhuǎn)180度不變形,則記為++);如混濁度和粘滯性明顯增加,呈膠體狀,但傾斜試管時(shí)變形,則記為+);如液體流動自如,透明無變化或稍混濁有少量顆粒細(xì)絮片狀物,則記為-。


如被檢樣品中有抑制物存在,則可將檢品作適當(dāng)?shù)南♂尰蚪?jīng)各種處理以除去抑制物,再次測試。如這些方法無效,亦可采用其它內(nèi)毒素檢測法,如RTRabbit pyrogen test家兔熱原實(shí)驗(yàn))法。


  1. 玻片法

鑒于試管法耗費(fèi)試劑量多,結(jié)果判定不易標(biāo)準(zhǔn)化,需用時(shí)間較長等缺點(diǎn),Frauch1974年首先創(chuàng)用了玻片法。將10μl試劑與已處理過的被檢樣品10μl滴于無菌無熱原的玻片上,充分混勻,水平放置37℃30分鐘,取出觀察結(jié)果。如標(biāo)本中含有內(nèi)毒素,則混合物形成凝膠,倒轉(zhuǎn)玻片時(shí)混合物不流動,觸之較結(jié)實(shí)。反之則說明樣本中不含內(nèi)毒素或內(nèi)毒素含量過低。


Goto等于1977年對此法進(jìn)行了兩點(diǎn)改進(jìn)。增加試劑及樣品的量,所用量各為20μl。由于Frauch法僅用10μl試劑及10μl的被檢標(biāo)本,量太少,且形成凝膠后其體積更小,不易判斷結(jié)果。故各增加試劑及被檢標(biāo)本量1倍,這樣結(jié)果判定更正確、容易些。②使用不含硅的玻片。由于硅玻璃組成的玻片,滴加在其上的液體可向四周擴(kuò)散,而顯得不規(guī)則。不含硅的玻片可使滴加在其上的液體保持穩(wěn)定,不向四周擴(kuò)散,這樣,為結(jié)果的判斷提取了方便。


  1. 細(xì)吸管法

此法由瑞典學(xué)者Gardi1980年首先創(chuàng)用。將10μl被檢標(biāo)10μl鱟試劑滴于無菌無熱原的載玻片上,充分混勻,然后以毛細(xì)吸管吸入其內(nèi)(一般2/3的高度),水平37℃孵育45-60分鐘,取出毛細(xì)吸管,浸入溴酚染料中23秒鐘,取出即可判斷結(jié)果。如染料能進(jìn)入毛細(xì)吸管,則說明樣品中無內(nèi)毒素或所含的內(nèi)毒素量低于鱟試劑檢測的敏感度記為-);如有堅(jiān)固凝膠形成以致染色不能浸入,即說明樣本含有內(nèi)毒素,記為(+。此法敏感性高、操作簡便、所需試劑少、孵育時(shí)間短結(jié)果判斷較客觀。

我們實(shí)驗(yàn)室于1982-1983年間應(yīng)用細(xì)吸管微量測定法對臨床的多種標(biāo)本進(jìn)行了內(nèi)毒素檢測,結(jié)果較為滿意,認(rèn)為此法值得在臨床上廣泛推廣。


目前,日本有專門的內(nèi)毒素微量檢測管出售,這種毛細(xì)吸管內(nèi)已裝有微量的凍干試劑,只需將此管插入液相標(biāo)本,取出孵育一定的時(shí)間后即能判斷結(jié)果。


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