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鱟試驗方法——用產(chǎn)色基質法檢測細菌內(nèi)毒素含量的方法

來源:科德角國際生物醫(yī)學科技(北京)有限公司   2022年08月11日 13:33  

日本學者對內(nèi)毒素的產(chǎn)色基質測定法Chromogenic subs-trate method進行了大量的研究。從試驗的反應機理可知,試劑中含有一種特異的前凝固酶,其受內(nèi)毒素激活后變成有活性的凝固酶,后者具有α-凝血酶的活性及Xa因子及Xa因子的一些功能。這種酶可水解凝固蛋白原成三個片段,即A鏈、B鏈及C肽。A、B鏈和C肽再通過共價相聯(lián)而成為凝膠。此酶作用的部位,分別為A鏈羧基端的-Val-Leu-Gly-ArgGlyArg 分別為第1718C肽的-Val- Ser-G1y-ArgG1y,Arg分別為第45、46上,提示羧基末端Gly-Arg的結構可受到血凝固酶的作用。鑒于此,利用人工合成的肽-硝基苯胺.肽一PNA或肽-4甲基香-豆素酰胺(肽-MCA基質中肽段氨基酸排列順序與凝固蛋白質切斷部位的氨基酸排列順序相同的特性,就可以由于這種酶的水解作用,使產(chǎn)色基質游離出來,即可用分光光度計于適當?shù)牟ㄩL處測得吸光度。

 

如用肽-PNA基質,則釋出的為PNA,可在405nm處測定吸光值。如用肽-MCA基質,即釋出7-氨基-4-甲基香-豆素AMC經(jīng)380nm波長紫外線激發(fā)后,460nm處可測得熒光,如用370nm波長亦可測知AMC的游離量。

 

目前應用的產(chǎn)色基質許多種,主要有:

Bz - lle - Glu - Gly -Arg - PNA

Bz - Val - Gly - Arg - PNA

Boc - Lue - Gly - Arg -PNA

Boc - Lue - Gly - Arg - PNA

Boc - Ser - Gly - Arg - PNA

Boc - Leu - Gly -Arg - MCA

Boc - Ser - Gly - Arg- MCA等。

 

這些基質對凝固酶的酰胺酶感性內(nèi)毒素濃度的提高和作用時間的延長而增強顯示其高度的專一性。測出內(nèi)毒素范圍5Pg-50ng/ml。反應時間延長測得更低的內(nèi)毒素值。反應需要的最適pH8.08.5。

 

在試驗時必須作陽性標準管,即以一定濃度0.100,0.025,0.075ng/ml的標準內(nèi)毒素與肽-PNA或肽-MCA反應,然后作出線性標準曲線。作出的標準曲線,其相關系數(shù)應>0.98,變異系數(shù)<5 %。被檢樣品的吸光值只要與標準曲線比較,即得知標本中所含的內(nèi)毒素量。亦可采用下列公式求得如下圖:

 

 

如果要測定血漿或血清中的內(nèi)毒素,則由于其中含有內(nèi)毒素抑制蛋白,可事先加熱3730分鐘,以破壞這些抑制物質,或通過稀釋的方法消去這些抑制物質。亦可在血清中加入標準內(nèi)毒素作出標準曲線。

 

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