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鱟試驗(yàn)方法——用產(chǎn)色基質(zhì)法檢測(cè)細(xì)菌內(nèi)毒素含量的方法

來(lái)源:科德角國(guó)際生物醫(yī)學(xué)科技(北京)有限公司   2022年08月11日 13:33  

日本學(xué)者對(duì)內(nèi)毒素的產(chǎn)色基質(zhì)測(cè)定法Chromogenic subs-trate method進(jìn)行了大量的研究。從試驗(yàn)的反應(yīng)機(jī)理可知,試劑中含有一種特異的前凝固酶,其受內(nèi)毒素激活后變成有活性的凝固酶,后者具有α-凝血酶的活性及Xa因子及Xa因子的一些功能。這種酶可水解凝固蛋白原成三個(gè)片段,即A鏈、B鏈及C肽。AB鏈和C肽再通過(guò)共價(jià)相聯(lián)而成為凝膠。此酶作用的部位,分別為A鏈羧基端的-Val-Leu-Gly-ArgGly,Arg 分別為第1718C肽的-Val- Ser-G1y-ArgG1y,Arg分別為第45、46上,提示羧基末端Gly-Arg的結(jié)構(gòu)可受到血凝固酶的作用。鑒于此,利用人工合成的肽-硝基苯胺.肽一PNA或肽-4甲基香-豆素酰胺(肽-MCA基質(zhì)中肽段氨基酸排列順序與凝固蛋白質(zhì)切斷部位的氨基酸排列順序相同的特性,就可以由于這種酶的水解作用,使產(chǎn)色基質(zhì)游離出來(lái),即可用分光光度計(jì)于適當(dāng)?shù)牟ㄩL(zhǎng)處測(cè)得吸光度。

 

如用肽-PNA基質(zhì),則釋出的為PNA,可在405nm處測(cè)定吸光值。如用肽-MCA基質(zhì),即釋出7-氨基-4-甲基香-豆素AMC經(jīng)380nm波長(zhǎng)紫外線激發(fā)后460nm處可測(cè)得熒光,如用370nm波長(zhǎng)亦可測(cè)知AMC的游離量。

 

目前應(yīng)用的產(chǎn)色基質(zhì)許多種,主要有:

Bz - lle - Glu - Gly -Arg - PNA

Bz - Val - Gly - Arg - PNA

Boc - Lue - Gly - Arg -PNA

Boc - Lue - Gly - Arg - PNA

Boc - Ser - Gly - Arg - PNA

Boc - Leu - Gly -Arg - MCA

Boc - Ser - Gly - Arg- MCA等。

 

這些基質(zhì)對(duì)凝固酶的酰胺酶感性內(nèi)毒素濃度的提高和作用時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)顯示其高度的專一性。測(cè)出內(nèi)毒素范圍5Pg-50ng/ml。反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)測(cè)得更低的內(nèi)毒素值。反應(yīng)需要的最適pH8.08.5

 

在試驗(yàn)時(shí)必須作陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)管,即以一定濃度0.1000.025,0.075ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素與肽-PNA或肽-MCA反應(yīng),然后作出線性標(biāo)準(zhǔn)曲線。作出的標(biāo)準(zhǔn)曲線,其相關(guān)系數(shù)應(yīng)>0.98,變異系數(shù)<5 %。被檢樣品的吸光值只要與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較,即得知標(biāo)本中所含的內(nèi)毒素量。亦可采用下列公式求得如下圖:

 

 

如果要測(cè)定血漿或血清中的內(nèi)毒素,則由于其中含有內(nèi)毒素抑制蛋白,可事先加熱3730分鐘,以破壞這些抑制物質(zhì),或通過(guò)稀釋的方法消去這些抑制物質(zhì)。亦可在血清中加入標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素作出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

 

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