動脈粥樣硬化是一種以動脈壁增厚、慢性炎癥和內(nèi)皮功能失調(diào)為特征的主要心血管疾病。病理性刺激引發(fā)內(nèi)皮功能障礙，導致血流異常，可能引發(fā)動脈血栓形成和終末器官缺血。這些事件發(fā)生在動脈的粥樣硬化易發(fā)區(qū)域，其中內(nèi)皮暴露于受干擾的血流或振蕩剪切應力（OSS），如在分叉處和彎曲處。

剪切應力已被證明在調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞表面機械敏感受體的激活中起關鍵作用。在暴露于某些類型的剪切應力（例如層流和高剪切應力）的區(qū)域中，內(nèi)皮細胞表現(xiàn)出動脈粥樣硬化保護特性，而暴露于擾流或 OSS 下的內(nèi)皮細胞表現(xiàn)出內(nèi)皮細胞表型的轉變，從而導致炎癥級聯(lián)，以及免疫細胞與內(nèi)皮的粘附。

黃酮醇是一類與植物色素沉著相關的生物類黃酮，已被證明具有顯著的抗氧化作用并調(diào)節(jié)細胞信號通路。胡桃苷是最近發(fā)現(xiàn)的一種黃酮醇化合物，它來源于普通核桃樹，還來源于一種低洼的一年生草本植物萹蓄。研究表明胡桃苷具有重要的抗氧化、抗炎和抗癌作用，但目前調(diào)查胡桃苷在動脈粥樣硬化中的作用的研究還很少。

在此項研究中，鄭州人民醫(yī)院心臟大血管外科、河南省人民醫(yī)院、阜外華中心血管病醫(yī)院的課題組評估了胡桃苷對暴露于 OSS 的人主動脈內(nèi)皮細胞的各種潛在的動脈粥樣硬化保護作用。

胡桃苷減少 OSS 誘導的氧化應激

OSS 誘導的氧化應激是導致內(nèi)皮功能障礙的主要因素，內(nèi)皮功能障礙是動脈粥樣硬化和心血管疾病的最早預測因子之一。NADPH 氧化酶-2（NOX-2）已被證明有助于 ROS 的產(chǎn)生，動脈粥樣硬化中的氧化應激和 NOX-2 的抑制可減少內(nèi)皮功能障礙。

實驗首先發(fā)現(xiàn)，暴露于 OSS 使 NOX-2 在 mRNA 和蛋白質水平上的表達分別增加了 3.9 倍和 3.3 倍。然而，用 2.5 和 5 µM 胡桃苷處理以劑量依賴性方式將 NOX-2 表達降低至 mRNA 水平的 2.5 和 1.4 倍，以及蛋白質水平的 2.2 和 1.5 倍（圖1）。接下來評估了胡桃苷對 OSS 誘導的 ROS 產(chǎn)生的影響。DHE 染色結果顯示，OSS 將 ROS 水平提高到 3.5 倍，而胡桃苷以劑量依賴性方式將 ROS 生成降低到僅 2.2 和 1.5 倍。

圖1 胡桃苷降低了人主動脈內(nèi)皮細胞（HAECs）中振蕩剪切應力（OSS）誘導的 NOX-2 表達。在存在或不存在 2.5 和 5 μM 胡桃苷的情況下，將細胞暴露于 OSS（5 dyn/cm2）24 小時。（A）NOX-2 的 mRNA 水平（B）NOX-2 的蛋白質水平

胡桃苷抑制 OSS 誘導的促炎細胞因子表達

為了評估胡桃苷對 OSS 誘導的氧化應激的影響，實驗使用實時 PCR 和 ELISA 分析測量了 IL-1β、MCP-1 和 HMGB1 的表達水平。

單獨使用 OSS 可使 IL-1β 的 mRNA 表達增加 4.4 倍，而 2.5 和 5 µM 胡桃苷將 IL-1β mRNA 表達降低至 2.7 和 1.8 倍（圖2 A）。

對于 MCP-1，兩種劑量的胡桃苷將 OSS 誘導的 5.7 倍減少到僅 3.4 和 2.5 倍。在蛋白質水平上，OSS 將 IL-1β 和 MCP-1 的表達分別從初始濃度 205.8 和 332.7 pg/ml 增加到 952.5 和 1522.8 pg/ml（圖2 B）。兩種劑量的胡桃苷分別將 IL-1β 的濃度降低到 658.2 和 512.9 pg/ml，將 MCP-1 的濃度分別降低到 1123.4 和 823.5 pg/ml。

單獨的 0.25-5μM 胡桃苷對 HMGB-1 的產(chǎn)生沒有任何顯著影響，但兩種較高劑量的 25 和 50μM 胡桃苷將 HMBG1 的濃度從 276.5 分別增加到 343.1、379.8 pg/mL。OSS 將 HMGB1 的濃度從 262.5 增加到 782.3 pg/ml，胡桃苷以劑量依賴性方式將其降低到僅 523.7 和 309.6 pg/ml。

因此，胡桃苷可能抑制 OSS 誘導的炎癥和單核細胞募集。

圖2 胡桃苷可降低 HAECs 中由 OSS 誘導的促炎細胞因子的表達。在存在或不存在 2.5 和 5 μM 胡桃苷的情況下，將細胞暴露于 OSS（5 dyn/cm2）24 小時。（A）IL-1β 和 MCP-1 的 mRNA 表達；（B）IL-1β 和 MCP-1 的分泌。

胡桃苷拯救了 eNOS 和 NO 的表達

接下來測量了在有或沒有胡桃苷的情況下暴露于 OSS 的 HAECs 中 eNOS 和 NO 的表達水平。OSS 使 eNOS 的 mRNA 表達降低了 61%，但在兩種劑量的胡桃苷存在下，eNOS mRNA 表達分別僅降低了 34% 和7%（圖3 A）。蛋白質印跡分析所示，OSS 下 eNOS 的蛋白質表達降低了 55% ，但在 2.5 和 5 µM 胡桃苷存在下僅降低了 26% 和 4%（圖3 B）。對于 NO 的產(chǎn)生，發(fā)現(xiàn) OSS 將 NO 水平降低了 62%，而 2.5 µM 胡桃苷將使 NO 水平降低到僅21%，而 5 µM 胡桃苷將 NO 水平比基線增加了 8%。因此，胡桃苷對 OSS 誘導的 eNOS 和 NO 表達降低具有有效的保護作用。

圖3 胡桃苷恢復了 OSS 誘導的 eNOS 和 NO 的降低。在存在或不存在 2.5 和 5 μM 胡桃苷的情況下，將細胞暴露于 OSS（5 dyn/cm2）24 小時。（A）eNOS 的 mRNA；（B）通過蛋白質印跡分析測量的 eNOS 蛋白質水平；（C）NO 濃度。

胡桃苷抑制單核細胞與內(nèi)皮細胞的粘附

為了確定胡桃苷對 OSS 誘導的單核細胞與內(nèi)皮細胞附著的影響，實驗測量了 VCAM-1 和 E-選擇素的表達水平，并量化了 THP-1 單核細胞與 HAECs 的附著。

OSS 分別將 VCAM-1 和 E-選擇素的 mRNA 表達增加至 4.1 倍和 4.9 倍（圖4 A）。然而，2.5 和 5 µM 胡桃苷將 VCAM-1 的 mRNA 表達降低到 2.5 和 1.6 倍，將 E-選擇素的 mRNA 表達降低到 3.3 和 2.1 倍。OSS 使 VCAM-1 和 E-選擇素的蛋白質表達增加 3.7 和 3.5 倍，但在較小劑量的胡桃苷存在下僅增加 2.5 和 2.3 倍，在大劑量下僅增加了 1.4 和 1.5 倍（圖4 B）。在共培養(yǎng)實驗中，發(fā)現(xiàn) OSS 使附著的 THP1 單核細胞的數(shù)量增加了 3.8 倍，而兩個劑量的胡桃苷使其減少到僅 2.2 倍和 1.5 倍。

這些結果表明胡桃苷具有預防動脈粥樣硬化病變形成的潛在重要能力。

圖4 胡桃苷降低了 OSS 誘導的 VCAM-1 和 E-選擇素的表達。在存在或不存在 2.5 和 5 μM 胡桃苷的情況下，將細胞暴露于 OSS（5 dyn/cm2）24 小時。（A）VCAM-1 和 E-選擇素的 mRNA 水平；（B）VCAM-1 和 E-選擇素的蛋白質水平。

胡桃素可挽救 OSS 誘導的 KLF2 表達降低

作為一種重要的動脈粥樣硬化保護因子，增強 KLF2 表達是一個有希望的治療靶點。實驗發(fā)現(xiàn)，OSS 將 KLF2 的 mRNA 表達水平降低了54%，而兩種劑量的胡桃苷將其挽救為 28% 和 4%。OSS 使 KLF2 的蛋白質表達降低了 58%，但在 2.5 和 5 μM 胡桃苷存在下僅降低了 31% 和 7%。因此，胡桃苷對 OSS 誘導的 KLF2 表達降低具有有效的劑量依賴性保護作用。

總的來說，該研究結果表明，胡桃苷可以防止各種促動脈粥樣硬化的 OSS 誘導的內(nèi)皮功能障礙。胡桃苷作為動脈粥樣硬化血管干預的候選藥物具有潛在的意義。

參考文獻：Zhao J, Quan X, Xie Z, Zhang L, Ding Z. Juglanin suppresses oscillatory shear stress-induced endothelial dysfunction: An implication in atherosclerosis. Int Immunopharmacol. 2020 Dec;89(Pt B):107048. doi: 10.1016/j.intimp.2020.107048. Epub 2020 Oct 10. PMID: 33049495.

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