動(dòng)脈粥樣硬化是一種以動(dòng)脈壁增厚、慢性炎癥和內(nèi)皮功能失調(diào)為特征的主要心血管疾病。病理性刺激引發(fā)內(nèi)皮功能障礙，導(dǎo)致血流異常，可能引發(fā)動(dòng)脈血栓形成和終末器官缺血。這些事件發(fā)生在動(dòng)脈的粥樣硬化易發(fā)區(qū)域，其中內(nèi)皮暴露于受干擾的血流或振蕩剪切應(yīng)力（OSS），如在分叉處和彎曲處。

剪切應(yīng)力已被證明在調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞表面機(jī)械敏感受體的激活中起關(guān)鍵作用。在暴露于某些類型的剪切應(yīng)力（例如層流和高剪切應(yīng)力）的區(qū)域中，內(nèi)皮細(xì)胞表現(xiàn)出動(dòng)脈粥樣硬化保護(hù)特性，而暴露于擾流或 OSS 下的內(nèi)皮細(xì)胞表現(xiàn)出內(nèi)皮細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)變，從而導(dǎo)致炎癥級(jí)聯(lián)，以及免疫細(xì)胞與內(nèi)皮的粘附。

黃酮醇是一類與植物色素沉著相關(guān)的生物類黃酮，已被證明具有顯著的抗氧化作用并調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)通路。胡桃苷是最近發(fā)現(xiàn)的一種黃酮醇化合物，它來源于普通核桃樹，還來源于一種低洼的一年生草本植物萹蓄。研究表明胡桃苷具有重要的抗氧化、抗炎和抗癌作用，但目前調(diào)查胡桃苷在動(dòng)脈粥樣硬化中的作用的研究還很少。

在此項(xiàng)研究中，鄭州人民醫(yī)院心臟大血管外科、河南省人民醫(yī)院、阜外華中心血管病醫(yī)院的課題組評(píng)估了胡桃苷對(duì)暴露于 OSS 的人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的各種潛在的動(dòng)脈粥樣硬化保護(hù)作用。

胡桃苷減少 OSS 誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激

OSS 誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激是導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙的主要因素，內(nèi)皮功能障礙是動(dòng)脈粥樣硬化和心血管疾病的最早預(yù)測(cè)因子之一。NADPH 氧化酶-2（NOX-2）已被證明有助于 ROS 的產(chǎn)生，動(dòng)脈粥樣硬化中的氧化應(yīng)激和 NOX-2 的抑制可減少內(nèi)皮功能障礙。

實(shí)驗(yàn)首先發(fā)現(xiàn)，暴露于 OSS 使 NOX-2 在 mRNA 和蛋白質(zhì)水平上的表達(dá)分別增加了 3.9 倍和 3.3 倍。然而，用 2.5 和 5 µM 胡桃苷處理以劑量依賴性方式將 NOX-2 表達(dá)降低至 mRNA 水平的 2.5 和 1.4 倍，以及蛋白質(zhì)水平的 2.2 和 1.5 倍（圖1）。接下來評(píng)估了胡桃苷對(duì) OSS 誘導(dǎo)的 ROS 產(chǎn)生的影響。DHE 染色結(jié)果顯示，OSS 將 ROS 水平提高到 3.5 倍，而胡桃苷以劑量依賴性方式將 ROS 生成降低到僅 2.2 和 1.5 倍。

圖1 胡桃苷降低了人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞（HAECs）中振蕩剪切應(yīng)力（OSS）誘導(dǎo)的 NOX-2 表達(dá)。在存在或不存在 2.5 和 5 μM 胡桃苷的情況下，將細(xì)胞暴露于 OSS（5 dyn/cm2）24 小時(shí)。（A）NOX-2 的 mRNA 水平（B）NOX-2 的蛋白質(zhì)水平

胡桃苷抑制 OSS 誘導(dǎo)的促炎細(xì)胞因子表達(dá)

為了評(píng)估胡桃苷對(duì) OSS 誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激的影響，實(shí)驗(yàn)使用實(shí)時(shí) PCR 和 ELISA 分析測(cè)量了 IL-1β、MCP-1 和 HMGB1 的表達(dá)水平。

單獨(dú)使用 OSS 可使 IL-1β 的 mRNA 表達(dá)增加 4.4 倍，而 2.5 和 5 µM 胡桃苷將 IL-1β mRNA 表達(dá)降低至 2.7 和 1.8 倍（圖2 A）。

對(duì)于 MCP-1，兩種劑量的胡桃苷將 OSS 誘導(dǎo)的 5.7 倍減少到僅 3.4 和 2.5 倍。在蛋白質(zhì)水平上，OSS 將 IL-1β 和 MCP-1 的表達(dá)分別從初始濃度 205.8 和 332.7 pg/ml 增加到 952.5 和 1522.8 pg/ml（圖2 B）。兩種劑量的胡桃苷分別將 IL-1β 的濃度降低到 658.2 和 512.9 pg/ml，將 MCP-1 的濃度分別降低到 1123.4 和 823.5 pg/ml。

單獨(dú)的 0.25-5μM 胡桃苷對(duì) HMGB-1 的產(chǎn)生沒有任何顯著影響，但兩種較高劑量的 25 和 50μM 胡桃苷將 HMBG1 的濃度從 276.5 分別增加到 343.1、379.8 pg/mL。OSS 將 HMGB1 的濃度從 262.5 增加到 782.3 pg/ml，胡桃苷以劑量依賴性方式將其降低到僅 523.7 和 309.6 pg/ml。

因此，胡桃苷可能抑制 OSS 誘導(dǎo)的炎癥和單核細(xì)胞募集。

圖2 胡桃苷可降低 HAECs 中由 OSS 誘導(dǎo)的促炎細(xì)胞因子的表達(dá)。在存在或不存在 2.5 和 5 μM 胡桃苷的情況下，將細(xì)胞暴露于 OSS（5 dyn/cm2）24 小時(shí)。（A）IL-1β 和 MCP-1 的 mRNA 表達(dá)；（B）IL-1β 和 MCP-1 的分泌。

胡桃苷拯救了 eNOS 和 NO 的表達(dá)

接下來測(cè)量了在有或沒有胡桃苷的情況下暴露于 OSS 的 HAECs 中 eNOS 和 NO 的表達(dá)水平。OSS 使 eNOS 的 mRNA 表達(dá)降低了 61%，但在兩種劑量的胡桃苷存在下，eNOS mRNA 表達(dá)分別僅降低了 34% 和7%（圖3 A）。蛋白質(zhì)印跡分析所示，OSS 下 eNOS 的蛋白質(zhì)表達(dá)降低了 55% ，但在 2.5 和 5 µM 胡桃苷存在下僅降低了 26% 和 4%（圖3 B）。對(duì)于 NO 的產(chǎn)生，發(fā)現(xiàn) OSS 將 NO 水平降低了 62%，而 2.5 µM 胡桃苷將使 NO 水平降低到僅21%，而 5 µM 胡桃苷將 NO 水平比基線增加了 8%。因此，胡桃苷對(duì) OSS 誘導(dǎo)的 eNOS 和 NO 表達(dá)降低具有有效的保護(hù)作用。

圖3 胡桃苷恢復(fù)了 OSS 誘導(dǎo)的 eNOS 和 NO 的降低。在存在或不存在 2.5 和 5 μM 胡桃苷的情況下，將細(xì)胞暴露于 OSS（5 dyn/cm2）24 小時(shí)。（A）eNOS 的 mRNA；（B）通過蛋白質(zhì)印跡分析測(cè)量的 eNOS 蛋白質(zhì)水平；（C）NO 濃度。

胡桃苷抑制單核細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的粘附

為了確定胡桃苷對(duì) OSS 誘導(dǎo)的單核細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞附著的影響，實(shí)驗(yàn)測(cè)量了 VCAM-1 和 E-選擇素的表達(dá)水平，并量化了 THP-1 單核細(xì)胞與 HAECs 的附著。

OSS 分別將 VCAM-1 和 E-選擇素的 mRNA 表達(dá)增加至 4.1 倍和 4.9 倍（圖4 A）。然而，2.5 和 5 µM 胡桃苷將 VCAM-1 的 mRNA 表達(dá)降低到 2.5 和 1.6 倍，將 E-選擇素的 mRNA 表達(dá)降低到 3.3 和 2.1 倍。OSS 使 VCAM-1 和 E-選擇素的蛋白質(zhì)表達(dá)增加 3.7 和 3.5 倍，但在較小劑量的胡桃苷存在下僅增加 2.5 和 2.3 倍，在大劑量下僅增加了 1.4 和 1.5 倍（圖4 B）。在共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn) OSS 使附著的 THP1 單核細(xì)胞的數(shù)量增加了 3.8 倍，而兩個(gè)劑量的胡桃苷使其減少到僅 2.2 倍和 1.5 倍。

這些結(jié)果表明胡桃苷具有預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化病變形成的潛在重要能力。

圖4 胡桃苷降低了 OSS 誘導(dǎo)的 VCAM-1 和 E-選擇素的表達(dá)。在存在或不存在 2.5 和 5 μM 胡桃苷的情況下，將細(xì)胞暴露于 OSS（5 dyn/cm2）24 小時(shí)。（A）VCAM-1 和 E-選擇素的 mRNA 水平；（B）VCAM-1 和 E-選擇素的蛋白質(zhì)水平。

胡桃素可挽救 OSS 誘導(dǎo)的 KLF2 表達(dá)降低

作為一種重要的動(dòng)脈粥樣硬化保護(hù)因子，增強(qiáng) KLF2 表達(dá)是一個(gè)有希望的治療靶點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，OSS 將 KLF2 的 mRNA 表達(dá)水平降低了54%，而兩種劑量的胡桃苷將其挽救為 28% 和 4%。OSS 使 KLF2 的蛋白質(zhì)表達(dá)降低了 58%，但在 2.5 和 5 μM 胡桃苷存在下僅降低了 31% 和 7%。因此，胡桃苷對(duì) OSS 誘導(dǎo)的 KLF2 表達(dá)降低具有有效的劑量依賴性保護(hù)作用。

總的來說，該研究結(jié)果表明，胡桃苷可以防止各種促動(dòng)脈粥樣硬化的 OSS 誘導(dǎo)的內(nèi)皮功能障礙。胡桃苷作為動(dòng)脈粥樣硬化血管干預(yù)的候選藥物具有潛在的意義。

參考文獻(xiàn)：Zhao J, Quan X, Xie Z, Zhang L, Ding Z. Juglanin suppresses oscillatory shear stress-induced endothelial dysfunction: An implication in atherosclerosis. Int Immunopharmacol. 2020 Dec;89(Pt B):107048. doi: 10.1016/j.intimp.2020.107048. Epub 2020 Oct 10. PMID: 33049495.

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