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Piuma生物納米壓痕儀在化學(xué)過(guò)程對(duì)關(guān)節(jié)軟骨原纖維的療效是滲透壓依賴性
目的：關(guān)節(jié)軟骨老化被認(rèn)為是骨關(guān)節(jié)炎（OA）的主要危險(xiǎn)因素，其中一部分可以通過(guò)晚期糖基化來(lái)解釋，該糖基化提供了交聯(lián)（例如戊四烯）在膠原分子內(nèi)的積累。這個(gè)過(guò)程導(dǎo)致組織的脆性和潛在的分解。此外，主要是金屬蛋白酶基質(zhì)蛋白（MMPs）的不可逆蛋白水解活性導(dǎo)致膠原纖維裂解，這也導(dǎo)致軟骨分解。以前的研究表明，分子和纖維形式以及角膜的機(jī)械拉伸可以保護(hù)膠原蛋白免受酶裂解。在這項(xiàng)研究中，我們研究了關(guān)節(jié)軟骨的膠原纖維拉伸對(duì)膠原酶酶活性以及非酶交聯(lián)活性的影響。
方法：采用兩個(gè)單獨(dú)的馬股骨髁提取相鄰的骨軟骨塞（直徑=8.5 mm）進(jìn)行交聯(lián)（n=5）和酶促（n=6）實(shí)驗(yàn)。解凍后，軟骨層被分成4個(gè)四分之一的圓盤，它們被滲透平衡（400 mOsm / kg水和4°C）約一小時(shí)。應(yīng)用微壓痕（半徑～50 μm和剛度～50 N/m，Piuma，Optics11，荷蘭）獲得1.5*1.5 mm的平均有效楊氏模量2包含 81 個(gè)等間距縮進(jìn)點(diǎn)的區(qū)域。然后將用于酶實(shí)驗(yàn)的圓盤在等離子（400 mOsm / kg水）和高補(bǔ)（4000 mOsm / kg水）條件下進(jìn)行機(jī)械預(yù)處理。此外，用于交聯(lián)實(shí)驗(yàn)的圓盤經(jīng)歷了次強(qiáng)直（100 mOsm / kg水）條件。此后，將酶促樣品在37oC下在II型膠原酶（0.5μM，Worthington生化公司）中孵育1小時(shí)，其相應(yīng)的滲透壓具有足夠的Ca供應(yīng)。處理后，將樣品重新平衡（400 mOsm / kg水和4°C）1小時(shí)，并在與初始步驟相同的區(qū)域進(jìn)行微壓痕。平均有效楊氏模量的相對(duì)差異被用作產(chǎn)生膠原裂解并降低剛度的化學(xué)活性的指示（膠原酶II型）或產(chǎn)生交聯(lián)和增加的剛度（L-threose）。此外，在L-threose中孵育后樣品的表面顏色被量化為非酶交聯(lián)效率的指示。++
結(jié)果：在高滲透壓條件下，用膠原酶II型處理的樣品的平均有效楊氏模量損失較低（圖1）。在所有組中，我們觀察到交聯(lián)過(guò)程的滲透壓依賴性趨勢(shì)（圖2）。滲透壓的增加與膠原纖維交聯(lián)的更高機(jī)會(huì)有關(guān)，如平均有效楊氏模量的變化所表明的那樣。此外，軟骨表面的顏色分析證實(shí)了隨著滲透壓的增加，交聯(lián)的增加，即向深黃色發(fā)展（圖3）。
結(jié)論：化學(xué)反應(yīng)被認(rèn)為是關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)幾種類型的膠原纖維改變的原因，即OA中發(fā)生的酶裂解和衰老中發(fā)生的晚期糖化或非酶交聯(lián)。減少這些糖基化反應(yīng)的一種方法是增強(qiáng)膠原纖維中的前應(yīng)力，這可以通過(guò)外部浴中的低滲透壓或增加蛋白聚糖含量來(lái)實(shí)現(xiàn)。在目前的研究中，我們表明膠原纖維預(yù)應(yīng)力在控制細(xì)菌膠原酶誘導(dǎo)的降解方面也起作用，盡管與糖基化過(guò)程相比，這是相反的。然而，滲透壓（即膠原纖維預(yù)應(yīng)力）對(duì)MMPs酶活性的影響尚未作為本研究的補(bǔ)充進(jìn)行研究。因此，宏觀尺度上的機(jī)械力可以極大地影響關(guān)節(jié)軟骨中膠原纖維內(nèi)的分子過(guò)程，這可能提供潛在的策略來(lái)限制它們，從而延長(zhǎng)關(guān)節(jié)軟骨的功能壽命。
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