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磷酸化蛋白富集試劑盒?使用方法

來源:上海研生實業(yè)有限公司   2022年08月23日 16:19  

磷酸化蛋白富集試劑盒使用方法:


準(zhǔn)備:第一次使用本試劑盒時需要將所有 DNase I 干粉倒入溶液 B 中,輕柔顛倒 使 DNase 干粉溶解。未用完的部分需要放-20℃保存,最好在一個月內(nèi)完,否則 DNase 將逐漸失去活性。此外,最好在實驗前 1 小時將溶液 B 冰浴預(yù)冷。 


用法一:小量制備(主要用于上樣量比較小的 SDS-PAGE 電泳等實驗)


1、 收集 20-40 mL 過夜培養(yǎng)的細(xì)菌飽和培養(yǎng)液(OD420 在 1.5 左右即可),2500 g 室溫離心 10 分鐘后棄上清。


2、 加入 2 mL 溶液 A,輕柔吹打,將細(xì)菌重懸于溶液 A 中。


3、 2500 g 室溫離心 10 分鐘后棄上清。 4、 加入 0.5 mL 溶液 B(必須已經(jīng)提前加入了 DNase I 干粉),輕柔吹打使細(xì)菌 重懸。注:如果細(xì)菌起始量沒有 20-40 mL,溶液 A 的用量可以等比例降低。 重懸在溶液 A 中的細(xì)菌可以放-80℃長期保存。 


5、 用超聲或 French Press 方法裂解細(xì)胞。如果用 French Press 方法,則需要 處理至少兩次,每次的壓力為 9.65×10E7(=14000 psi)。注意:不論用哪 種裂解方法,都必須在顯微鏡下檢查細(xì)菌是否已經(jīng)裂解,否則還需要重復(fù)細(xì)菌 裂解過程,直到 80%以上的細(xì)菌都裂解為止。


6、 2500g 室溫離心 8 分鐘后小心轉(zhuǎn)移上清到新的 10 mL-15 mL 塑料離心管中 (如 Beckman Optima 臺式超速離心機離心管),棄沉淀(未破裂細(xì)胞)。


7、 在上清(細(xì)菌裂解液)中加入 5 mL 預(yù)冷的溶液 C,輕柔顛倒混勻后冰浴放置 30-60 分鐘。其間可以輕柔顛倒混勻 3-5 次。


8、 用 Bechman Optima 臺式超速離心機 115,000g 4℃離心 60 分鐘。也可以 使用其他冷凍超速離心機,但離心力應(yīng)該一致,否則有可能得不到沉淀。


9、 小心移棄上清,在沉淀中加入 0.2 mL 溶液 A,充分吹打混勻。


10、用 Beckman Optima 臺式超速離心機 115,000g 4℃離心 60 分鐘。也可 以使用其他冷凍超速離心機,但離心力應(yīng)該一致,否則有可能得不到沉淀。 11、小心移棄上清,所得沉淀放-20℃長期保存,也可以直接加入 0.1 mL 自備的, 跟后續(xù)實驗兼容的緩沖液(如 1×SDS-PAGE 上樣液中,可從本公司購買), 所得膜蛋白的濃度將在 1mg/mL 左右。


用法二:大量制備(主要用于上樣量比較大的 2D 電泳等實驗) 


1、 收集 200-400 mL 過夜培養(yǎng)的細(xì)菌飽和培養(yǎng)液(OD420 在 1.5 左右即可),2500 g 室溫離心 10 分鐘后棄上清。


2、 加入 20 mL 溶液 A,輕柔吹打,將細(xì)菌重懸于溶液 A 中。


3、 2500 g 室溫離心 10 分鐘后棄上清。


4、 加入 5 mL 溶液 B(必須已經(jīng)提前加入了 DNase I 干粉),輕柔吹打使細(xì)菌重懸。注:如果細(xì)菌起始量沒有 200-400 mL,溶液 A 的用量可以等比例降低。重懸在溶液 A 中的細(xì)菌可以放-80℃長期保存。


5、 用超聲或 French Press 方法裂解細(xì)胞。如果用 French Press 方法,則需要處理至少兩次,每次的壓力為 9.65×10E7(=14000 psi)。注意:不論用哪種裂解方法,都必須在顯微鏡下檢查細(xì)菌是否已經(jīng)裂解,否則還需要重復(fù)細(xì)菌裂解過程,直到 80%以上的細(xì)菌都裂解為止。


6、 2500g 室溫離心 8 分鐘后小心轉(zhuǎn)移上清到干凈的玻璃燒杯中,棄沉淀(未破裂細(xì)胞)。


7、 在上清(細(xì)菌裂解液)中加入 50 mL 預(yù)冷的溶液 C,輕輕在冰浴中攪拌混勻30-60 分鐘。注:可以在大燒杯中裝冰,然后將裝有樣品的小燒杯放入,在放入干凈的攪拌子,以最di速度攪拌。


8、 用 Beckman Type 55.2 Ti 轉(zhuǎn)頭 115,000g 4℃離心 60 分鐘。也可以使用其他冷凍超速離心機,但離心力應(yīng)該一致。


9、 小心移棄上清,在沉淀中加入 2 mL 溶液 A,充分吹打混勻。


10、用 Beckman Type 55.2 Ti 轉(zhuǎn)頭 115,000g 4℃離心 60 分鐘。也可以使用其他冷凍超速離心機,但離心力應(yīng)該一致。


11、小心移棄上清,所得沉淀放-20℃長期保存或溶解在 1 mL 自備的,跟后續(xù)實驗兼容的緩沖液(如 1×等電點電泳上樣液,可從本公司購買),所得膜蛋白的濃度在 1mg/mL 左右。

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