流式細(xì)胞術(shù)是一種生物學(xué)技術(shù),用于對懸浮于流體中的微小顆粒進(jìn)行計(jì)數(shù)和分選。這種技術(shù)可以用來對流過光學(xué)或電子檢測器的一個(gè)個(gè)細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)的多種參數(shù)分析。 流式細(xì)胞術(shù)(Flow CytoMetry,F(xiàn)CM)是對懸液中的單細(xì)胞或其他生物粒子,通過檢測標(biāo)記的熒光信號,實(shí)現(xiàn)高速、逐一的細(xì)胞定量分析和分選的技術(shù)。
主要特點(diǎn)
1.測量速度快;2.可進(jìn)行多參數(shù)測量;3.是一門綜合性的高科技方法( FCM綜合了光學(xué),電子學(xué),流體力學(xué),細(xì)胞化學(xué),免疫學(xué),激光和計(jì)算機(jī)等多門學(xué)科和技術(shù));4.既是細(xì)胞分析技術(shù),又是精確的分選技術(shù)。
工作原理
將待測細(xì)胞染色后制成單細(xì)胞懸液。用一定壓力將待測樣品壓入流動室,不含細(xì)胞的磷酸緩沖液在高壓下從鞘液管噴出,鞘液管入口方向與待測樣品流成一定角度,這樣,鞘液就能夠包繞著樣品高速流動,組成一個(gè)圓形的流束,待測細(xì)胞在鞘液的包被下單行排列,依次通過檢測區(qū)域。
流式細(xì)胞儀通常以激光作為發(fā)光源。經(jīng)過聚焦整形后的光束,垂直照射在樣品流上,被熒光染色的細(xì)胞在激光束的照射下,產(chǎn)生散射光和激發(fā)熒光。這兩種信號同時(shí)被前向光電二極管和90°方向的光電倍增管接收。光散射信號在前向小角度進(jìn)行檢測,這種信號基本上反映了細(xì)胞體積的大小;熒光信號的接受方向與激光束垂直,經(jīng)過一系列雙色性反射鏡和帶通濾光片的分離,形成多個(gè)不同波長的熒光信號。
這些熒光信號的強(qiáng)度代表了所測細(xì)胞膜表面抗原的強(qiáng)度或其核內(nèi)物質(zhì)的濃度,經(jīng)光電倍增管接收后可轉(zhuǎn)換為電信號,再通過模/數(shù)轉(zhuǎn)換器,將連續(xù)的電信號轉(zhuǎn)換為可被計(jì)算機(jī)識別的數(shù)字信號。計(jì)算機(jī)把所測量到的各種信號進(jìn)行計(jì)算機(jī)處理,將分析結(jié)果顯示在計(jì)算機(jī)屏幕上,也可以打印出來,還可以數(shù)據(jù)文件的形式存儲在硬盤上以備日后的查詢或進(jìn)一步分析。
檢測數(shù)據(jù)的顯示視測量參數(shù)的不同由多種形式可供選擇。單參數(shù)數(shù)據(jù)以直方圖的形式表達(dá),其X軸為測量強(qiáng)度,Y軸為細(xì)胞數(shù)目。一般來說,流式細(xì)胞儀坐標(biāo)軸的分辨率有512或1024通道數(shù),這視其模數(shù)轉(zhuǎn)換器的分辨率而定。對于雙參數(shù)或多參數(shù)數(shù)據(jù),既可以單獨(dú)顯示每個(gè)參數(shù)的直方圖,也可以選擇二維的三點(diǎn)圖、等高線圖、灰度圖或三維立體視圖。
細(xì)胞的分選是通過分離含有單細(xì)胞的液滴而實(shí)現(xiàn)的。在流動室的噴口上配有一個(gè)超高頻電晶體,充電后振動,使噴出的液流斷裂為均勻的液滴,待測定細(xì)胞就分散在這些液滴之中。將這些液滴充以正負(fù)不同的電荷,當(dāng)液滴流經(jīng)帶有幾千伏特的偏轉(zhuǎn)板時(shí),在高壓電場的作用下偏轉(zhuǎn),落入各自的收集容器中,不予充電的液滴落入中間的廢液容器,從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的分離。
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