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如何制備優(yōu)質(zhì)單細(xì)胞懸液,幾個(gè)小TIPS包教包會(huì)

來(lái)源:德祥科技有限公司   2022年08月26日 13:05  

時(shí)下細(xì)胞研究很火的科研技術(shù)當(dāng)屬單細(xì)胞測(cè)序,但此技術(shù)對(duì)細(xì)胞懸浮液的總量以及活性都有一定的要求,因此制備高質(zhì)量的單細(xì)胞懸浮液成為實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵點(diǎn)。



單細(xì)胞測(cè)序涉及的細(xì)胞類型多種多樣,如腸、肺、PBMC、胚胎、神經(jīng)、乳腺、干細(xì)胞等,而其中樣本的處理消化亦是重中之重,樣本前處理與后續(xù)的分析結(jié)果有著莫大的關(guān)聯(lián)。如何在上機(jī)前得到非常優(yōu)質(zhì)的懸液呢?這里和大家分享一些制備優(yōu)質(zhì)單細(xì)胞懸液的tips。


1、在樣本采集過程中,建議采用無(wú)菌樣品處理方式,包括使用不含核酸酶的試劑和耗材;


2、實(shí)體組織需要先處理,傳統(tǒng)組織處理方法有機(jī)械法,包括網(wǎng)搓法、研磨法。機(jī)械法一般適用樣本類型為脾臟、淋巴結(jié)、胸腺;另外較溫和的方法有酶解法(使用胰蛋白酶類、膠原酶、溶菌酶、彈性蛋白酶以及一些商業(yè)化包裝的組合酶),適用樣本類型有肝臟、腎臟、心臟、肺臟、脊髓、腦、腸道、皮膚、腫瘤等。


3、如果您使用的是10x Genomics相關(guān)儀器和平臺(tái),可以從查看10x Genomics不同樣本單細(xì)胞懸液制備建議或者利用關(guān)鍵詞查詢與自己樣本類型相同的已發(fā)表的單細(xì)胞測(cè)序文獻(xiàn)。對(duì)于如何獲得高質(zhì)量的樣品,10X公司建議在單細(xì)胞懸液制備過程中,細(xì)胞重懸的緩沖液選用無(wú)Ca2+、Mg2+EDTA1× PBS,并用0.04% non-acetylated BSA清洗兩次(300rcf,5min),選擇其他緩沖液或培養(yǎng)基可能會(huì)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生不同程度的影響。


4、細(xì)胞在處理過程受到外界環(huán)境影響,其基因表達(dá)譜可能會(huì)出現(xiàn)一些變化;有些細(xì)胞對(duì)環(huán)境極為敏感,可能會(huì)死亡裂解,造成RNA降解從而造成檢測(cè)中的背景細(xì)胞升高,進(jìn)而影響所獲得的數(shù)據(jù)質(zhì)量。實(shí)驗(yàn)過程中需要盡量避免細(xì)胞死亡,不斷優(yōu)化細(xì)胞處理?xiàng)l件,加快實(shí)驗(yàn)流程的進(jìn)度,減小對(duì)細(xì)胞的影響。


5單細(xì)胞懸液制備過程中出現(xiàn)的細(xì)胞團(tuán)、細(xì)胞碎片或纖維等雜質(zhì)會(huì)增加微流體芯片的堵塞風(fēng)險(xiǎn)。如果存在細(xì)胞碎片和大團(tuán)塊,請(qǐng)將樣品通過 40 µm Flowmi 細(xì)胞過濾器,細(xì)胞懸液體積損失小。



 

圖源:10x Genomics Protocol《 Fresh Frozen Human Peripheral Blood Mononuclear Cells for Single Cell RNA Sequencing




圖源:《10x Genomics®Single Cell Protocols——Cell Preparation Guide



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