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鱟試驗(yàn)法中鱟試劑及內(nèi)毒素的標(biāo)化問(wèn)題

來(lái)源:科德角國(guó)際生物醫(yī)學(xué)科技(北京)有限公司   2022年08月31日 10:33  

一、試劑的標(biāo)化問(wèn)題

試劑為變形細(xì)胞的細(xì)胞溶解物,制備時(shí)可采用裂解法和機(jī)械方法使細(xì)胞破裂。試劑的敏感性可受到動(dòng)物個(gè)體差異、季節(jié)差異及生產(chǎn)工藝過(guò)程中不穩(wěn)定因素的影響。因此各批次間,其敏感性差異很大。即使是同一批試劑,由于操作、保存方法、環(huán)境因素等影響,其敏感性亦不一樣。試劑在液態(tài)時(shí)極不穩(wěn)定,往往很難保存。貯存于4 ℃冰箱,其活性一般于4~5月開(kāi)始下降,8個(gè)月左右*失活。冷凍保存的穩(wěn)定性稍高于液態(tài)保存。`真空凍干粉劑保存為目前最-好的方法,- 30℃保存其有效期可達(dá)2年。

改善生產(chǎn)工藝,控制制劑中的參數(shù),可使試劑的敏感性和穩(wěn)定性增高。國(guó)內(nèi)丁友玲等報(bào)道,試劑含水量控制在5%以下,總蛋白量控制在5mg/ml以上,Ca++、Mg++控制在0.01~0.1M,可使試驗(yàn)的穩(wěn)定性提高,重演性增強(qiáng)。

試驗(yàn)前,應(yīng)以WHO標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素作標(biāo)定,如試劑敏感性為1ng/ml小于1ng /ml,則認(rèn)為是敏感的,可以應(yīng)用。美國(guó)制備了參考試劑,各種試劑在應(yīng)用前與其比較,可獲得相對(duì)效力。

除應(yīng)解決好試劑的標(biāo)化問(wèn)題外,對(duì)試劑的操作程序亦應(yīng)標(biāo)化,因?yàn)椴僮魃衔⑿〉牟町惣纯墒乖噭┑拿舾行愿淖儭?/span>

二、內(nèi)毒素的標(biāo)化問(wèn)題

從各種細(xì)菌制備的內(nèi)毒素,或以同一種細(xì)菌制備的內(nèi)毒素,或內(nèi)毒素批次間、批次內(nèi),其活性均可不一致。所以應(yīng)用LT法(鱟試驗(yàn)法,Limulus test)檢測(cè)內(nèi)毒素時(shí),需要一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的內(nèi)毒素作為對(duì)照參比。

大腸桿菌內(nèi)毒素在各種細(xì)菌內(nèi)毒素的LT反應(yīng)上處于中值的位置(圖4),且其穩(wěn)定、可溶,因此將大腸桿菌內(nèi)毒素作為參考標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素(Reference Standar d En-dotoxin,RSE)是較為適宜的。

根據(jù)以上理由及原則,美國(guó)FDA下屬的生物制品管理局(BOB)組織了大規(guī)模的研究。制備了一系列標(biāo)準(zhǔn)參考內(nèi)毒素表4)。分別命名為16、EC、EC-1,EC-2………,EC-5。其中EC-2是以大腸桿菌O111B4。(Braude株)提取的,各項(xiàng)指標(biāo)均為滿意。

日本從大腸桿菌UKTB中提取了內(nèi)毒素,作為日本的標(biāo)準(zhǔn)參考內(nèi)毒素,采用酚水抽提法,然后再用乙醇沉淀?;瘜W(xué)分析、熱原性及鱟試劑激活性*符合RSE的標(biāo)準(zhǔn)。且其在干燥狀態(tài)下穩(wěn)定性極-好,可長(zhǎng)期應(yīng)用,但如溶于水,則穩(wěn)定性可下降。

最近美國(guó)藥品部門已向WHO提供了一批新的RSE供國(guó)際上檢測(cè)時(shí)作為參比用,這使LT試驗(yàn)結(jié)果容易統(tǒng)一。實(shí)際上WHO對(duì)此早就組織了合作研究,包括多種試劑及內(nèi)毒素。

從理論上講一種RSE需滿足下述條件①干燥制劑;②在性質(zhì)是可用的③在室溫下穩(wěn)定;④吸濕性少;⑤易溶于水⑥在水及生理鹽水中清澈;⑦可致家兔及人反應(yīng)⑧須從常見(jiàn)的菌株提取。

但目前所有RSE均不*符合上述條件,因此,有關(guān)內(nèi)毒的標(biāo)化問(wèn)題仍須進(jìn)行深入的研究。

具體檢測(cè)時(shí),各實(shí)驗(yàn)室可采用對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素(Control Standard Endotoxin,CSE),但其效能必須先以RSE進(jìn)行標(biāo)定。CSE效能的計(jì)算公式為:

CSE效能=GM比值×E  Eu/μg

其中GM比值為算術(shù)平均值,E為RSE的效能,常為6000Eu/管,CSE與 RSE作平行的LT試驗(yàn)試管數(shù)N應(yīng)大于16,然后算出CSE與RSE相應(yīng)的比值R1,R2,……RN,將這些比值換算成以10為底的對(duì)數(shù)值,然后計(jì)算平均和標(biāo)準(zhǔn)的SD,平均SD的反對(duì)數(shù)即為GM比值。

1981年9月美國(guó)、日本、英國(guó)、西德、瑞典、意大利六國(guó)學(xué)者及監(jiān)定部門的代表在美國(guó)Woods Hole 海洋學(xué)院召開(kāi)了用于注射用品的試劑和內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)的國(guó)際會(huì)議,會(huì)上Difco實(shí)驗(yàn)室的Fleishman報(bào)告了“自多種革蘭氏陰性菌內(nèi)毒素的LT法檢測(cè)熱原的比較”一文,提出了被檢內(nèi)毒素相對(duì)活力的概念,即與參考標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素EC-2比較后的相對(duì)活力,計(jì)算公式如下圖:

其中5 Eu/ng是FDA標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素EC-2的指-定活力。

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