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細(xì)菌內(nèi)毒素(脂多糖)提取法之三氯醋酸法及酚水法的介紹

來(lái)源:科德角國(guó)際生物醫(yī)學(xué)科技(北京)有限公司   2022年09月08日 09:41  

內(nèi)毒素系革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁外膜中的脂多糖(Lipopoly saccharide,LPS)成分。在維持外膜的結(jié)構(gòu)、通透性以及臨床陰性菌感染中均起著重要的作用。以化學(xué)方法提取的LPS注射動(dòng)物能重復(fù)革蘭氏陰性菌感染期間所出現(xiàn)的多種病理反應(yīng),故實(shí)驗(yàn)動(dòng)物應(yīng)用提取的LPS可更好地了解LPS的致病作用并尋找可能的防治對(duì)策。

 

 

一、三氯醋酸法(Trichloroacetic Acid,TCA)

 

TCA法是Boivin等(1933)首先應(yīng)用的,借助0.25N TCA,在4℃可將LPS從濕菌或經(jīng)丙酮干燥的細(xì)菌中提取出來(lái),加入2倍體積的冷乙醇即可取得LPS的沉淀物。用這種方法提取的產(chǎn)物,嚴(yán)格地講是一種LPS-蛋自質(zhì)復(fù)合物,這種復(fù)合物即方早期所稱的Boivin抗原。TCA法提取的LPS產(chǎn)量較高,具有很好的抗原性,對(duì)O特異性側(cè)鏈抗體有血清學(xué)特異反應(yīng),可結(jié)合補(bǔ)體和致敏紅細(xì)胞,分子量達(dá)幾百萬(wàn),但蛋白質(zhì)含量很高,故純度較差。目前這一方法已較少使用。

 

二、酚水法

 

這一方法是Westphal等于1952年提出的,該法是目前應(yīng)用最-廣泛的方法。酚水法主要用于S型細(xì)菌LPS的提取,亦可用于R突變型細(xì)菌LPS的提取,但產(chǎn)量稍低。酚水法提取液所含的苯酚與水的比例是45 : 55。當(dāng)提取液加熱至68℃并維持5分鐘時(shí),苯酚和水形成了一個(gè)單一的相,冷卻至4℃后,形成了兩個(gè)相,分別為苯酚相(被水飽和)和水相(被苯酚飽和)。核酸、多糖及LPS大部分溶解于水相中,而大部分蛋白質(zhì)溶解于苯酚相中,不溶性物質(zhì)沉淀在兩相交界處。

 

含LPS的水相經(jīng)吸取、透析〈去除苯酚)并干燥后即為L(zhǎng)PS的粗制品。LPS粗制品經(jīng)超離心1000000×g,可得到精制的LPS。精制后的LPS,尚含有多糖成分及與其共價(jià)結(jié)合的類脂體A成分、小量的肽(1~3 %)。這種提取物對(duì)人、兔的抗原較弱,但能展示O特異性側(cè)鏈抗原反應(yīng)。內(nèi)毒素毒性較強(qiáng),致敏紅細(xì)胞不明顯,能結(jié)合補(bǔ)體,分子量有幾百萬(wàn)。產(chǎn)量?jī)H1~4 %(占干菌重)。

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