四環(huán)素誘導(dǎo)系統(tǒng)—穩(wěn)定開合基因

來源：蘇州海星生物科技有限公司 2022年09月08日 11:36

四環(huán)素控制的Tet-Off（tTA系統(tǒng)）和Tet-On（rtTA）系統(tǒng)基因表達(dá)系統(tǒng)被用來在不同的環(huán)境下對真核細(xì)胞的基因活性進(jìn)行調(diào)控，靈活控制基因的開或關(guān)，其主要是基于細(xì)菌中常用的誘導(dǎo)基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子四環(huán)素阻遏蛋白（Tet repressor protein, TetR）和四環(huán)素操縱子（Tet operator, TetO）結(jié)合的原理。

1992年，Gossen 等人手次建立了“Tet-Off”系統(tǒng)（tTA系統(tǒng)），tTA是由大腸桿菌Tn10的TetR結(jié)合域與VP16（單純皰疹病毒）的轉(zhuǎn)錄激活域融合而成，該系統(tǒng)的另一部分是由啟動子復(fù)合物（TetO組成的四環(huán)素反應(yīng)原件TRE插入到巨細(xì)胞最小啟動子Pcmv上游組成)驅(qū)動的目的基因表達(dá)質(zhì)粒, 由于該系統(tǒng)的關(guān)閉需要持續(xù)的給予誘導(dǎo)藥物，如Dox（一種四環(huán)素衍生物），目前該系統(tǒng)的應(yīng)用場景受限。

1995年，Gossen及其同事開發(fā)了第二種誘導(dǎo)系統(tǒng)，即反向四環(huán)素控制轉(zhuǎn)錄激活系統(tǒng)(rtTA)或“Tet-On”系統(tǒng)。這個系統(tǒng)包含兩部分：弟一個是轉(zhuǎn)錄調(diào)控原件即rtTA，由一個突變的TetR與VP16融合形成；第二個結(jié)構(gòu)與tTA系統(tǒng)相同。這個系統(tǒng)在沒有誘導(dǎo)劑四環(huán)素的情況下，rtTA不與TRE結(jié)合或結(jié)合弱，在四環(huán)素作用下，rtTA與TRE結(jié)合，進(jìn)而激活靶基因。

但是rtTA的泄露問題一直存在，之后，為了解決rtTA的泄露問題，科學(xué)家們研發(fā)了多種突變體來減少泄露。此外，科學(xué)家研發(fā)了一種活性轉(zhuǎn)錄抑制因子（tTS），可以與rtTA系統(tǒng)結(jié)合使用，從而減少目的基因的基礎(chǔ)泄漏，同時rtTA可正常誘導(dǎo)目的基因表達(dá)基因。tTS是由大腸桿菌的TetR和KRAB-AB（Kid-1蛋白轉(zhuǎn)錄抑制結(jié)構(gòu)域）組成的融合蛋白。由于其具有沉默結(jié)構(gòu)域，當(dāng)四環(huán)素不存在的情況下，tTS與TRE啟動子結(jié)合，抑制基因轉(zhuǎn)錄，當(dāng)系統(tǒng)中存在足夠濃度的四環(huán)素時，tTS發(fā)生構(gòu)象變化，與TRE分離，解除轉(zhuǎn)錄抑制，使rtTA與TRE結(jié)合并激活基因轉(zhuǎn)錄。tTS系統(tǒng)結(jié)合rtTA已被證明能在體外培養(yǎng)的細(xì)胞中對報告基因進(jìn)行精確的調(diào)控。

四環(huán)素誘導(dǎo)系統(tǒng)因其強(qiáng)大的基因調(diào)控作用受到眾多研究者的青睞，海星生物利用二代Tet-ON 系統(tǒng)，將Tet-on系統(tǒng)與Piggybac轉(zhuǎn)座子載體結(jié)合，推出基于四環(huán)素誘導(dǎo)系統(tǒng)的過表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)株構(gòu)建服務(wù)，在減少泄露的同時，可實現(xiàn)大片段的基因組穩(wěn)定整合，表型穩(wěn)定，表達(dá)效率高，省去病毒包裝周期，縮短實驗周期的同時實現(xiàn)目的基因的穩(wěn)定開合。

案例：

技術(shù)流程

參考文獻(xiàn)：

· lGossen M, Bujard H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proc Natl Acad Sci U S A. 1992 Jun 15;89(12):5547-51. doi: 10.1073/pnas.89.12.5547. PMID: 1319065; PMCID: PMC49329.

· lGossen M, Freundlieb S, Bender G, Müller G, Hillen W, Bujard H. Transcriptional activation by tetracyclines in mammalian cells. Science. 1995 Jun 23;268(5218):1766-9. doi: 10.1126/science.7792603. PMID: 7792603.

· lZhu Z, Zheng T, Lee CG, Homer RJ, Elias JA. Tetracycline-controlled transcriptional regulation systems: advances and application in transgenic animal modeling. Semin Cell Dev Biol. 2002 Apr;13(2):121-8. doi: 10.1016/s1084-9521(02)00018-6. PMID: 12127145.

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