細(xì)菌內(nèi)毒素(脂多糖)的的純化
脂多糖(Lipopoly saccharide,LPS)是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁中的一種成分,脂多糖對(duì)宿主是有毒性的。脂多糖只有當(dāng)細(xì)菌死亡溶解或用人工方法破壞菌細(xì)胞后才釋放出來(lái),所以叫做內(nèi)毒素。
三氯醋酸法(Trichloroacetic Acid,TCA)、酚水法、苯酚╱氯仿╱石油醚法(PCP)、DMSO法、高壓超聲處理法所提取的LPS或多或少受到蛋白質(zhì)、核酸及多糖的污染,故需作一定的純化。LPS的純化方法目前最-常用的為超速離心(4萬(wàn)轉(zhuǎn)×4小時(shí),共三次),在這一條件下,LPS可沉淀下去,而蛋白質(zhì)、核酸及多糖則保留在上清液中,去除上清液即可得到較為純化的LPS。
但是這一方法需時(shí)較長(zhǎng),且質(zhì)量過(guò)關(guān)的超速離心機(jī)目前在國(guó)內(nèi)亦不十分普及,故而難以推廣應(yīng)用。我們?cè)趯?shí)際工作中體會(huì)到,用任何方法提取的LPS,可再以PCP純化一次(140ml/g LPS),然后只需一次超離,即可取得高度純化的LPS。
提取的LPS除可被蛋白質(zhì)、核酸及多糖污染外,還可被一些小分子物質(zhì),如多胺、陽(yáng)離子(Ca++、Mg++、K+等)的污染。通過(guò)電透析可將這類小分子物質(zhì)除去。此時(shí)形成的LPS為酸性LPS(由LPS中類脂A上的磷酸基團(tuán)形成的)。應(yīng)用堿中和LPS,可變成LPS的鹽。如用NaOH中和則可變成LPS鈉鹽,而應(yīng)用三乙基乙胺則可變成LPS三乙胺鹽、后者極易溶解于水,已廣泛地應(yīng)用于生物學(xué)研究。
綜上所述,LPS提取方法較多,應(yīng)當(dāng)根據(jù)菌種和實(shí)驗(yàn)條件而選用合適方法。PCP法對(duì)R型菌尤顯長(zhǎng)處,高壓超聲法雖可用于S或R菌,但方法步驟繁雜;DMSO法與TCA法已很少用到;而酚水法無(wú)論產(chǎn)量,純度及物理性質(zhì)均較滿意的,不失為一個(gè)實(shí)用的方法。LPS純化目前一般采用PCP法及一次超速離心,應(yīng)用該法可使LPS污染物包括蛋白質(zhì)、核酸及多糖除去,而應(yīng)用片透析方法,則可除去LPS中的小分子物質(zhì)如多胺、二價(jià)陽(yáng)離子,從而可得LPS轉(zhuǎn)化成實(shí)驗(yàn)需要的鹽類。
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