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【LNP/AAV】脂質(zhì)載體的生物物理表征方法
利用光散射和量熱技術(shù)對用于疫苗和治療的病毒和脂質(zhì)載體進行生物物理表征
作者：Natalia Markova, Stefan Cairns, Hanna Jankevics-Jones, Michael Kaszuba, Fanny Caputo and Jérémie Parot
近期，馬爾文帕納科應(yīng)用科學(xué)家和挪威SINTEF工業(yè)生物技術(shù)和納米醫(yī)學(xué)部的科學(xué)家們在Vaccines雜志上發(fā)表一篇名為《利用光散射和量熱技術(shù)對用于疫苗和治療的病毒和脂質(zhì)體進行生物物理表征》的文章。
文章對多種用于新型疫苗研發(fā)制造的病毒或非病毒載體的表征方法做了專業(yè)的介紹。文中所述多種無標記生物物理技術(shù)作為互補的分析工具可廣泛用于AAV 和LNP的設(shè)計、表征和質(zhì)量控制。且已經(jīng)成功的用于表征AAV和LNP等藥物載體的物理、化學(xué)屬性，本文將對該項研究做簡要介紹。
原文：Vaccines 2022, 10, 49
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引言
病毒載體和脂質(zhì)納米顆粒（LNP）的結(jié)構(gòu)復(fù)雜性影響其功能和藥物配方的成功性。這類分子被用作核酸（mRNA，DNA）的遞送平臺后，如何準確表征這些顆粒變得越來越重要。
在設(shè)計、產(chǎn)品開發(fā)和過程控制中，理化屬性的表征和質(zhì)量控制需要選擇合適、互相補充的分析工具。選擇合適的技術(shù)來監(jiān)測樣品需要考慮載體的性質(zhì)、測量處于產(chǎn)品開發(fā)的哪個階段、以及測量的目的?？煽康臏y量結(jié)果和對數(shù)據(jù)的充分解析依賴深厚的方法學(xué)專業(yè)知識和全面的數(shù)據(jù)分析方法。
這里，我們將介紹如何通過綜合使用互相補充的、非標記生物物理技術(shù)，包括動態(tài)光散射（DLS）、多角度光散射（MADLS）、電泳光散射（ELS）、納米顆粒跟蹤分析（NTA）、多檢測器SEC和差示掃描量熱法（DSC），表征包裹mRNA的病毒載體和LNPs的理化屬性。
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樣品
使用病毒和非病毒載體樣品，包括包裹mRNA的脂質(zhì)納米顆粒（mRNA-LNPs），脂質(zhì)體和腺相關(guān)病毒（AAV）。
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測量內(nèi)容與檢測技術(shù)
Zetasizer Ultra
Zetasizer Ultra 納米粒度及電位分析儀
Zetasizer Ultra 是快速而準確地測量顆粒和分子大小、顆粒電荷以及顆粒濃度的伴侶，其擁有用于高分辨率粒度測量切角度無關(guān)的多角度動態(tài)光散射（MADLS）技術(shù)可以更深入地展現(xiàn)樣品的顆粒分布，電泳光散射（ELS）技術(shù)可用于測量顆粒和分子的Zeta電位，以顯示樣品的穩(wěn)定性和/或團聚傾向性。可以用于rAAV 顆粒的粒徑及衣殼滴度的表征。
NanoSight NS300
Nanosight NS300 納米顆粒跟蹤分析儀
采用納米粒子跟蹤分析 (NTA) 技術(shù)，馬爾文帕納科NanoSight 這種技術(shù)利用光散射和布朗運動的特性，獲得納米顆粒大小 0.01 - 1µm及顆粒濃度，以及實時表征蛋白質(zhì)聚合(聚集)的解決方案。這使得 NTA成為病毒疫苗研究、納米毒物學(xué)和生物標志物檢測以及疾病狀態(tài)研究的細胞外囊泡、外泌體表征的重要技術(shù)。
MicroCal PEAQ DSC
MicroCal PEAQ DSC差示掃描量熱儀
差示掃描量熱法（DSC）是一種功能強大的分析技術(shù)，用于表征和分析蛋白質(zhì)和其他生物分子的熱穩(wěn)定性。
OMNISEC
OMNISEC 尺寸排阻色譜儀
OMNISEC是個多檢測器SEC系統(tǒng)，包括示差檢測器（RI）、紫外檢測器（UV）、光散射檢測器（LS）和粘度檢測器（IV）。可以用于表征和研究附著在脂質(zhì)納米顆粒顆粒遞送載體上的藥物量以及產(chǎn)品的分子量和結(jié)構(gòu)。
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測量案例展示
粒徑分布測量
使用DLS、MADLS、NTA和SEC-SLS/UV/RI測量不同大小、不同粒徑分布的樣品。
樣品：圖A/B LNP1，C/D LNP2，E/F 脂質(zhì)體，G/H AAV
顆粒濃度測量
使用MADLS、NTA和SEC-SLS/UV/RI。需要根據(jù)載體大小選擇合適的技術(shù)，這也決定了可測量的濃度范圍。
Zeta電位測量
Zeta電位可用于測量粒子在緩沖液/培養(yǎng)液中的電荷。下例是使用Zetasizer選配的MPT3滴定儀評估樣品在pH 2.5-9.5范圍內(nèi)的行為。樣品LNP1和LNP2的區(qū)別僅在于使用的可電離脂質(zhì)不同，在pH 4.5-7區(qū)間可見二者的差異。
有效載荷比測量
使用SEC-SLS/UV/RI測量LNPs內(nèi)mRNA的比率。
樣品：a) LNP1；b) LNP2
熱穩(wěn)定性
下述DSC熱譜圖分別是（A）同一個LNP2樣品取2份進行測量，展示了測量良好的可重復(fù)性（B）對比不同批次LNP2，結(jié)果差異較大（C）溶液中游離mRNA的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變和部分可逆性。
主要結(jié)論
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互補和正交的分析技術(shù)是驗證和/或洞察樣品行為的重要工具。
2
測量顆粒大小和濃度時，選擇何種分析方法主要取決于載體的大小和粒度分布。同時，分析的目的也會影響分析方法的選擇，比如是想了解樣品自上一步驟以來是否發(fā)生了變化，還是樣品中存在哪些低聚形態(tài)，每種形態(tài)占比多少？
3
Zeta電位可提供樣品在緩沖液中的電荷信息，或是如本文案例中，用于了解使用不同脂質(zhì)體的樣品在一定pH范圍內(nèi)的差異。
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使用SEC-SLS/UV/RI系統(tǒng)的光散射和雙濃度檢測器進行樣品的分離和分析，可分別量化脂質(zhì)體和mRNA，如本文中測量的LNP中的mRNA質(zhì)量百分比。
5
DSC可用于研究復(fù)雜LNP體系及其中組分如mRNA的熱誘導(dǎo)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變。DSC熱譜圖可用作定性和定量的指紋圖譜，用于樣品批次一致性的分析。
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