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特異鱟試劑制備的方法

來源:科德角國際生物醫(yī)學(xué)科技(北京)有限公司   2022年09月27日 10:44  

自從1981年日本學(xué)者Kakinuma A 等報道“一種抗癌物質(zhì)( 1-3) -β-D-葡聚糖[(1-3)-β-D-Glucan可使試劑凝聚”以來,由于其涉及細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的特異性,引起各國學(xué)者的注意。

 

 

一、(1-3-β-D-葡聚糖的本質(zhì)與來源

 

Kakinuma A等在作抗癌物質(zhì)葡聚糖熱原試驗(yàn)時,不含發(fā)熱物質(zhì)的葡聚糖能引起試驗(yàn)呈陽性反應(yīng)Loretta APearsen FC也報道,血液透析器上存在試驗(yàn)反應(yīng)物質(zhì)LAL-Reactive Materia lLAL-RM,以后有報道凡經(jīng)過銅銨人造絲透析膜的制品均存在使試驗(yàn)陽性,但不是內(nèi)毒素的物質(zhì)。1983年日本學(xué)者中村隆范報道了這一物質(zhì)具有如下結(jié)構(gòu):

 

1-3-β-葡聚糖外,1-41-6-β-葡聚糖同樣使試驗(yàn)產(chǎn)生陽性結(jié)果,這些物質(zhì)的總稱為真菌多糖Fungal polysaccharide,普遍存在于真菌細(xì)胞壁。如果這類物質(zhì)具有像內(nèi)毒素一樣的致熱活性,細(xì)菌內(nèi)毒素檢查和熱原檢查結(jié)果的符合率會接近一致。但是恰恰相反,真菌多糖似乎不是一種致熱物質(zhì),文獻(xiàn)報道1.0、0.01、0. 0001mg/mL的真菌多糖溶液,劑量按10mL/kg,進(jìn)行熱原試驗(yàn)的結(jié)果,3h內(nèi)3只家兔最高升溫的均值分別為0.23±0.03,0.13±0. 090.20±0.10。這將導(dǎo)致在使用普通試劑檢測某些樣品時,出現(xiàn)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查不合格,熱原檢查合格的現(xiàn)象。造成對這些物質(zhì)熱原檢查的錯判。1990Ikemura K等將試驗(yàn)反應(yīng)機(jī)理和各種干擾內(nèi)毒素檢查物質(zhì)及干擾部位歸納如下:

 

 

由此可知,鱟試劑檢測內(nèi)毒素出現(xiàn)非特異性結(jié)果是不奇怪的。為了使細(xì)菌內(nèi)毒素檢查與熱原檢查的結(jié)果趨向一致,使用特異試劑是*必要的。

 

二、特異試劑制備

 

1968Levin JBang F B創(chuàng)建試劑以來,使內(nèi)毒素的檢測成為靈敏、快速、簡便的方法,已被舉世*,并被美、日、中、歐洲藥典以《細(xì)菌內(nèi)毒素試驗(yàn)》收載,但是由于上述非特異性的存在,使這一試驗(yàn)的實(shí)際應(yīng)用受到一定限制。為了克服這一弊端,各國學(xué)者進(jìn)行了深入研究。由于上述試驗(yàn)反應(yīng)機(jī)理已被闡明,設(shè)法阻止右側(cè)旁路反應(yīng),便能使試劑對內(nèi)毒素的檢測達(dá)到特異性的目的。

 

日本最先推出的特異試劑其商品名為En-dospecy其生產(chǎn)工藝的特點(diǎn)是將普通試劑中存在的G因子,以親和層析方法分離去除。國內(nèi)有人稱無;G因子試劑。顯然,試劑中沒有G因子,即使被測樣品中存在真菌多糖非內(nèi)毒素,也不能產(chǎn)生活化的G因子在反應(yīng)旁路系統(tǒng)中就不能激活凝固酶原,旁路反應(yīng)被阻斷,使成為對內(nèi)毒素具有特異性。

 

國內(nèi)吳偉洪等報道以同樣方法制備了僅含C、B因子的試劑。但是以這種工藝制備的特異試劑,由于在分離G因子的過程中,必需防止帶入微量內(nèi)毒素,即所用分離試劑、柱床、器皿及操作過程,嚴(yán)防內(nèi)毒素污染,不僅增加了制備工藝的難度,也必然增加試劑的成本,因此很難推廣應(yīng)用。

 

1989Berzofsty R N報道,在制備普通試劑時,為了提高檢測內(nèi)毒素的靈敏度,均采用氯仿提取存在于試劑粗制品中的抗LPS脂多糖因子。氯仿提取的結(jié)果確實(shí)增加了試劑的靈敏度,但同時將存在于試劑粗制品中的抗G因子一同除去,這就使普通試劑易被真菌多糖激活增加了普通試劑的非特異性。因此提出不用氯仿提取,改用一種特殊試劑,只除去抗LPS因子,而保留抗G因子,以達(dá)到即增加了對內(nèi)毒素的敏感性,又削弱了真菌多糖活性G因子的能力。這是從試劑的生產(chǎn)工藝上進(jìn)行改革,實(shí)現(xiàn)提供商品特異試劑的一種方法。

 

1990Tsuchiya M報道,由于真菌多糖與普通試劑反應(yīng)形成凝膠有一個特定濃度范圍10 -3~10-6mg/mL,大于或小于這個濃度都不能成膠,故在制備普通試劑的基礎(chǔ)上,加入過量的真菌多糖( 1mg/mL),可阻止G因子的活化,“封閉”了旁路,達(dá)到制備特異試劑的目的。顯然采用這一措施制備特異試劑,較以上兩種方法既簡便又經(jīng)濟(jì),可使特試劑商品化。

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