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循環(huán)拉伸應力下人成纖維細胞早期成骨中整合素αVβ3-肌動蛋白絲軸的調(diào)控

來源:上海泉眾機電科技有限公司   2022年09月28日 13:31  

成纖維細胞是間充質(zhì)基質(zhì)中常見的貼壁細胞類型。成纖維細胞和間充質(zhì)干細胞具有相似的 MSC 標記,可以分化成成骨、脂肪和軟骨細胞譜系。成纖維細胞和間充質(zhì)干細胞的相似性支持使用成纖維細胞作為研究成骨的合適細胞類型。當干細胞處于由生物材料、生長因子和組織組成的微環(huán)境中時,適當?shù)臋C械刺激可以促進干細胞的成骨分化。臨床和基礎研究表明,外部機械刺激,例如因拉伸而增加的張力,可以影響干細胞的成骨分化。機械轉導通常通過整合素將機械刺激轉化為生化信號,然后影響下游細胞活動的過程。


整合素是存在于細胞表面的跨膜受體,是由非共價鍵連接的αβ亞基組成的功能性異二聚體。整合素的聚集和激活募集和激活細胞內(nèi)信號蛋白,如粘著斑激酶FAK、紐蛋白和踝蛋白,它們有助于粘著斑并影響干細胞的分化。


Yes 相關蛋白(YAP)是一種轉錄共激活因子,通過與可控制轉錄的 TEADTEA 結構域 DNA 結合轉錄因子家族)DNA 結合蛋白結合,促進細胞增殖并調(diào)節(jié)干細胞分化。研究表明,通過敲除肌動蛋白細胞骨架的調(diào)節(jié)因子或用 F-肌動蛋白抑制藥物處理來控制 F-肌動蛋白水平會顯著影響 YAP 活性。然而,機械刺激如何通過整合素-微絲軸影響 YAP 以調(diào)節(jié)干細胞成骨分化仍不清楚。


廣東省醫(yī)學生物力學重點實驗室、廣州醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院眼科的課題組曾研究了整合素αVβ3與循環(huán)拉伸應力(CTS)誘導的早期成骨分化之間的關系。整合素αVβ3的激活導致肌動蛋白絲重排并調(diào)節(jié)核YAP的表達。此外還發(fā)現(xiàn)FAK參與了粘著斑的形成,整合素αVβ3介導的FAK磷酸化在CTS誘導的成骨分化早期發(fā)揮了作用。該研究表明整合素αVβ3可作為骨修復的治療靶點。



循環(huán)拉伸應力促進成纖維細胞中的細胞增殖和成骨


研究探討了循環(huán)拉伸應力0.5 Hz,10%)、細胞增殖和成纖維細胞成骨分化之間的關系。首先,成纖維細胞暴露于循環(huán)拉伸應力 4 天和 7 天。如圖1 a,成纖維細胞增殖響應于循環(huán)拉伸應力而增加。作為成骨分化標志物的 ALP RUNX2 的蛋白質(zhì)和 RNA 表達在循環(huán)拉伸應力下 7 天后增加(圖1 c、d)。成纖維細胞的 ALP 染色也獲得了類似的結果,在循環(huán)拉伸應力下ALP 染色更高(圖1 b)。這些結果表明,循環(huán)拉伸應力促進了成纖維細胞的細胞增殖和早期成骨分化。


1   CTS下成纖維細胞中細胞增殖、早期成骨分化和整合素αVβ3的表達。

a)細胞增殖在 CTS 1 天、4 天、7 天。(b ALP 染色在CTS 4 天和 7 天。(cALPRUNX2蛋白表達在CTS4天和7天。(d ALPRUNX2 mRNA表達在CTS4天和7天。(e)整合素αVβ3 mRNA表達在CTS4天和7天。(f)整合素 αVβ3 的免疫熒光在 CTS 7 天。





循環(huán)拉伸應力誘導的早期成骨分化依賴于整合素αVβ3的表達和激活


為了探索整合素是否參與循環(huán)拉伸應力誘導的成骨分化和細胞增殖,通過qRT-PCR和免疫熒光分析了整合素αVβ3在成纖維細胞中的表達。實驗發(fā)現(xiàn)整合素αVβ3的表達在循環(huán)拉伸應力下增加(圖1 e、f),表明循環(huán)拉伸應力促進整合素αVβ3的表達。因此,研究了循環(huán)拉伸應力下整合素αVβ3與成骨分化之間的關聯(lián)。為了確定循環(huán)拉伸應力是否以整合素αVβ3依賴性方式刺激成骨分化,整合素αVβ3的功能被整合素αVβ3的拮抗劑shRNARGDyk抑制。如圖2 a,當成纖維細胞中整合素αVβ3的表達下調(diào)時,循環(huán)拉伸應力下細胞增殖減少。


然后,通過 ALP 染色、蛋白質(zhì)印跡和 qRT-PCR 檢測整合素 αVβ3 對成骨分化的影響。shRNA-整合素αVβ3組的ALP染色比CTS組少(圖2 b)。蛋白質(zhì)印跡顯示,在成纖維細胞中整合素αVβ3表達下調(diào)后,ALPRUNX2的蛋白質(zhì)表達降低(圖2 ce)。通過 qRT-PCR 獲得了類似的結果,當整合素 αVβ3 表達被抑制時,ALP RUNX2 mRNA 的表達降低(圖2 d、f)。這些結果表明,循環(huán)拉伸應力通過整合素αVβ3促進成纖維細胞的早期成骨分化和細胞增殖。



2   CTS 通過整合素 αVβ3 調(diào)節(jié)細胞增殖和早期成纖維細胞成骨分化。

aGMNC、shRNA-整合素αVshRNA-整合素β3組在CTS下的細胞增殖。(bGM、NCshRNA-整合素αVshRNA-整合素β3組在CTS下的ALP染色。(c)在 GM RGDyk 組中 CTS ALP RUNX2 的蛋白質(zhì)表達。(dGM RGDyk 組在 CTS ALP RUNX2 mRNA 表達。(e)在 CTS GM、NCshRNA-整合素 αV shRNA-整合素 β3 組中 ALP RUNX2 的蛋白質(zhì)表達。(fCTS GM、NC、shRNA-整合素 αV shRNA-整合素 β3 組中 ALP RUNX2 mRNA 表達




成骨過程中通過整合素αVβ3調(diào)節(jié)循環(huán)拉伸應力的肌動蛋白絲


為了更好地了解循環(huán)拉伸應力下整合素αVβ3與肌動蛋白絲之間的關聯(lián),實驗檢測了整合素αVβ3被抑制時β-肌動蛋白的表達。蛋白質(zhì)印跡和qRT-PCR顯示β-肌動蛋白的表達在循環(huán)拉伸應力下增加。當整合素 αVβ3 的表達受到抑制時,RGDyk 組中 β-肌動蛋白的表達低于 CTS 組。還發(fā)現(xiàn) shRNA-整合素 αV β3 組中 β-肌動蛋白的表達低于 CTS 組。免疫熒光顯示,微絲應力纖維在循環(huán)拉應力作用下呈網(wǎng)狀分散在靠近細胞膜的結構中。當整合素αVβ3的表達受到抑制時,微絲應力纖維以與GM(培養(yǎng)基)組相似的拉長方式排列。這些結果表明,循環(huán)拉伸應力上調(diào)β-肌動蛋白的表達并通過整合素αVβ3改變肌動蛋白絲的結構。


為了研究肌動蛋白絲是否參與由循環(huán)拉伸應力誘導的成骨分化,使用細胞松弛素D 來抑制肌動蛋白絲的聚合。蛋白質(zhì)印跡顯示,在循環(huán)拉伸應力下,細胞松弛素D降低了ALPRUNX2的表達。這些結果表明,循環(huán)拉伸應力通過整合素αVβ3-微絲軸調(diào)節(jié)成纖維細胞成骨分化的早期階段。




成骨過程中通過整合素αVβ3-微絲軸調(diào)節(jié)循環(huán)拉伸應力核YAP


實驗還探討了循環(huán)拉伸應力是否通過整合素αVβ3-微絲軸調(diào)節(jié)核 YAP 的表達。蛋白質(zhì)印跡和qRT-PCR顯示核YAP的表達在循環(huán)拉伸應力下增加。當整合素αVβ3的表達受到抑制時,蛋白質(zhì)印跡顯示核YAP的表達低于CTS組。免疫熒光結果顯示,在循環(huán)拉應力作用下,核YAP的表達明顯增加。此外還發(fā)現(xiàn),當整合素 αVβ3 被抑制時,核 YAP 的表達降低。這些結果表明,循環(huán)拉伸應力通過整合素αVβ3上調(diào)核YAP。


當細胞松弛素D 抑制 β-肌動蛋白的聚合時,蛋白質(zhì)印跡和免疫熒光顯示核 YAP 的表達在循環(huán)拉伸應力下降低。蛋白質(zhì)印跡還顯示,在維替泊芬存在下,在循環(huán)拉伸應力下ALPRUNX2的表達降低。上述實驗表明,在成骨分化早期,循環(huán)拉伸應力通過整合素αVβ3-微絲軸調(diào)節(jié)核YAP。



循環(huán)拉伸應力促進成骨過程中粘著斑的形成和 FAK 磷酸化


由肌動蛋白絲和整合素形成的粘著斑需要踝蛋白(talin)、FAK 和紐蛋白(vinculin)才能將 CTS 傳遞到基底。實驗檢測了 talin-1、FAK vinculin 的表達,以探索它們與整合素 αVβ3 的關聯(lián)。蛋白質(zhì)印跡和qRT-PCR顯示在循環(huán)拉伸應力下talin-1、FAKvinculin的表達增加(圖3 ab)。蛋白質(zhì)印跡顯示,當整合素αVβ3的表達被cRGDyk)或shRNA抑制時,talin-1,FAKvinculin的表達降低(圖3 ce)。qRT-PCR 獲得了類似的結果(圖3 df)。免疫熒光顯示,紐蛋白在循環(huán)拉伸應力下的可見粘著斑斑塊中表達和定位更高。整合素αVβ3的抑制與紐蛋白表達的顯著降低相關(圖3 g)。這些結果表明,循環(huán)拉伸應力通過整合素αVβ3促進粘著斑的形成。


接下來,研究了 FAK 磷酸化在循環(huán)拉伸應力下在成骨分化中的作用。蛋白質(zhì)印跡顯示FAK的磷酸化響應于循環(huán)拉伸應力而增加,并且整合素αVβ3的抑制下調(diào)了FAK的磷酸化(圖3 h、i)。實驗發(fā)現(xiàn),當 FAK 的磷酸化被 Y-15(一種小分子抑制劑)抑制時,ALP RUNX2 的表達降低(圖3 j)。這些結果表明,FAK不僅參與了含有整合素αVβ3的粘著斑的形成,而且FAK的磷酸化有助于循環(huán)拉伸應力誘導的成骨分化的早期階段。





3   CTS 誘導的整合素 αVβ3 激活調(diào)節(jié)粘著斑相關蛋白和 FAK 的磷酸化,以促進成骨分化的早期階段。

atalin-1、FAK vinculin 的蛋白質(zhì)表達在 CTS 4 天和 7 天。(btalin-1、FAKvinculin mRNA表達在CTS4天和7天。(cGM RGDyk 組中 CTS talin-1、FAK vinculin 的蛋白質(zhì)表達。(dGM RGDyk 組在 CTS talin-1、FAK vinculin mRNA 表達。(e)在 CTS GM、NC、shRNA-整合素αV shRNA-整合素 β3 組中 talin-1、FAK vinculin 的蛋白質(zhì)表達。(fGM、NC、shRNA-整合素αVshRNA-整合素β3組在CTStalin-1、FAKvinculinmRNA表達。(gGMCTS、NC、shRNA-integrin αV shRNA-integrin β3 組在 CTS 下的 vinculin 免疫熒光 7 天。(hCTS FAK 磷酸化水平 7 天。(iCTS GM、NC、shRNA-整合素 αV shRNA-整合素 β3 組中 FAK 的磷酸化水平。(jCTSCTS組和Y15ALPRUNX2蛋白表達。




循環(huán)拉伸應力通過整合素αVβ3的激活對成纖維細胞早期成骨分化產(chǎn)生積極影響,導致微絲細胞骨架的重排。此外,循環(huán)拉伸應力刺激的肌動蛋白絲的重排和 FAK 的磷酸化通過整合素 αVβ3 導致人成纖維細胞中核 YAP 的表達增加。在未來的研究中,整合素αVβ3應該被認為是體內(nèi)實驗的一個有希望的靶點,以驗證其促進骨修復的功能。





參考文獻:Peng Y, Qu R, Feng Y, Huang X, Yang Y, Fan T, Sun B, Khan AU, Wu S, Dai J, Ouyang J. Regulation of the integrin αVβ3- actin filaments axis in early osteogenesis of human fibroblasts under cyclic tensile stress. Stem Cell Res Ther. 2021 Oct 7;12(1):523. doi: 10.1186/s13287-021-02597-y. PMID: 34620239; PMCID: PMC8496073.



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