成纖維細(xì)胞是間充質(zhì)基質(zhì)中常見的貼壁細(xì)胞類型。成纖維細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞具有相似的 MSC 標(biāo)記，可以分化成成骨、脂肪和軟骨細(xì)胞譜系。成纖維細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞的相似性支持使用成纖維細(xì)胞作為研究成骨的合適細(xì)胞類型。當(dāng)干細(xì)胞處于由生物材料、生長因子和組織組成的微環(huán)境中時，適當(dāng)?shù)臋C(jī)械刺激可以促進(jìn)干細(xì)胞的成骨分化。臨床和基礎(chǔ)研究表明，外部機(jī)械刺激，例如因拉伸而增加的張力，可以影響干細(xì)胞的成骨分化。機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)通常通過整合素將機(jī)械刺激轉(zhuǎn)化為生化信號，然后影響下游細(xì)胞活動的過程。

整合素是存在于細(xì)胞表面的跨膜受體，是由非共價鍵連接的α和β亞基組成的功能性異二聚體。整合素的聚集和激活募集和激活細(xì)胞內(nèi)信號蛋白，如粘著斑激酶（FAK）、紐蛋白和踝蛋白，它們有助于粘著斑并影響干細(xì)胞的分化。

Yes 相關(guān)蛋白（YAP）是一種轉(zhuǎn)錄共激活因子，通過與可控制轉(zhuǎn)錄的 TEAD（TEA 結(jié)構(gòu)域 DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子家族）DNA 結(jié)合蛋白結(jié)合，促進(jìn)細(xì)胞增殖并調(diào)節(jié)干細(xì)胞分化。研究表明，通過敲除肌動蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)因子或用 F-肌動蛋白抑制藥物處理來控制 F-肌動蛋白水平會顯著影響 YAP 活性。然而，機(jī)械刺激如何通過整合素-微絲軸影響 YAP 以調(diào)節(jié)干細(xì)胞成骨分化仍不清楚。

廣東省醫(yī)學(xué)生物力學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、廣州醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院眼科的課題組曾研究了整合素αVβ3與循環(huán)拉伸應(yīng)力（CTS）誘導(dǎo)的早期成骨分化之間的關(guān)系。整合素αVβ3的激活導(dǎo)致肌動蛋白絲重排并調(diào)節(jié)核YAP的表達(dá)。此外還發(fā)現(xiàn)FAK參與了粘著斑的形成，整合素αVβ3介導(dǎo)的FAK磷酸化在CTS誘導(dǎo)的成骨分化早期發(fā)揮了作用。該研究表明整合素αVβ3可作為骨修復(fù)的治療靶點(diǎn)。

循環(huán)拉伸應(yīng)力促進(jìn)成纖維細(xì)胞中的細(xì)胞增殖和成骨

研究探討了循環(huán)拉伸應(yīng)力（0.5 Hz，10%）、細(xì)胞增殖和成纖維細(xì)胞成骨分化之間的關(guān)系。首先，成纖維細(xì)胞暴露于循環(huán)拉伸應(yīng)力 4 天和 7 天。如圖1 a，成纖維細(xì)胞增殖響應(yīng)于循環(huán)拉伸應(yīng)力而增加。作為成骨分化標(biāo)志物的 ALP 和 RUNX2 的蛋白質(zhì)和 RNA 表達(dá)在循環(huán)拉伸應(yīng)力下 7 天后增加（圖1 c、d）。成纖維細(xì)胞的 ALP 染色也獲得了類似的結(jié)果，在循環(huán)拉伸應(yīng)力下ALP 染色更高（圖1 b）。這些結(jié)果表明，循環(huán)拉伸應(yīng)力促進(jìn)了成纖維細(xì)胞的細(xì)胞增殖和早期成骨分化。

圖1   CTS下成纖維細(xì)胞中細(xì)胞增殖、早期成骨分化和整合素αVβ3的表達(dá)。

（a）細(xì)胞增殖在 CTS 下 1 天、4 天、7 天。（b ）ALP 染色在CTS 下 4 天和 7 天。（c）ALP和RUNX2蛋白表達(dá)在CTS下4天和7天。（d ）ALP和RUNX2 mRNA表達(dá)在CTS下4天和7天。（e）整合素αVβ3 mRNA表達(dá)在CTS下4天和7天。（f）整合素 αVβ3 的免疫熒光在 CTS 下 7 天。

循環(huán)拉伸應(yīng)力誘導(dǎo)的早期成骨分化依賴于整合素αVβ3的表達(dá)和激活

為了探索整合素是否參與循環(huán)拉伸應(yīng)力誘導(dǎo)的成骨分化和細(xì)胞增殖，通過qRT-PCR和免疫熒光分析了整合素αVβ3在成纖維細(xì)胞中的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)整合素αVβ3的表達(dá)在循環(huán)拉伸應(yīng)力下增加（圖1 e、f），表明循環(huán)拉伸應(yīng)力促進(jìn)整合素αVβ3的表達(dá)。因此，研究了循環(huán)拉伸應(yīng)力下整合素αVβ3與成骨分化之間的關(guān)聯(lián)。為了確定循環(huán)拉伸應(yīng)力是否以整合素αVβ3依賴性方式刺激成骨分化，整合素αVβ3的功能被整合素αVβ3的拮抗劑shRNA或RGDyk抑制。如圖2 a，當(dāng)成纖維細(xì)胞中整合素αV或β3的表達(dá)下調(diào)時，循環(huán)拉伸應(yīng)力下細(xì)胞增殖減少。

然后，通過 ALP 染色、蛋白質(zhì)印跡和 qRT-PCR 檢測整合素 αVβ3 對成骨分化的影響。shRNA-整合素αV和β3組的ALP染色比CTS組少（圖2 b）。蛋白質(zhì)印跡顯示，在成纖維細(xì)胞中整合素αVβ3表達(dá)下調(diào)后，ALP和RUNX2的蛋白質(zhì)表達(dá)降低（圖2 c、e）。通過 qRT-PCR 獲得了類似的結(jié)果，當(dāng)整合素 αVβ3 表達(dá)被抑制時，ALP 和 RUNX2 mRNA 的表達(dá)降低（圖2 d、f）。這些結(jié)果表明，循環(huán)拉伸應(yīng)力通過整合素αVβ3促進(jìn)成纖維細(xì)胞的早期成骨分化和細(xì)胞增殖。

圖2   CTS 通過整合素 αVβ3 調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和早期成纖維細(xì)胞成骨分化。

（a）GM、NC、shRNA-整合素αV和shRNA-整合素β3組在CTS下的細(xì)胞增殖。（b）GM、NC、shRNA-整合素αV和shRNA-整合素β3組在CTS下的ALP染色。（c）在 GM 和 RGDyk 組中 CTS 下 ALP 和 RUNX2 的蛋白質(zhì)表達(dá)。（d）GM 和 RGDyk 組在 CTS 下 ALP 和 RUNX2 的 mRNA 表達(dá)。（e）在 CTS 下GM、NC、shRNA-整合素 αV 和 shRNA-整合素 β3 組中 ALP 和 RUNX2 的蛋白質(zhì)表達(dá)。（f） CTS 下 GM、NC、shRNA-整合素 αV 和 shRNA-整合素 β3 組中 ALP 和 RUNX2 的 mRNA 表達(dá)

成骨過程中通過整合素αVβ3調(diào)節(jié)循環(huán)拉伸應(yīng)力的肌動蛋白絲

為了更好地了解循環(huán)拉伸應(yīng)力下整合素αVβ3與肌動蛋白絲之間的關(guān)聯(lián)，實(shí)驗(yàn)檢測了整合素αVβ3被抑制時β-肌動蛋白的表達(dá)。蛋白質(zhì)印跡和qRT-PCR顯示β-肌動蛋白的表達(dá)在循環(huán)拉伸應(yīng)力下增加。當(dāng)整合素 αVβ3 的表達(dá)受到抑制時，RGDyk 組中 β-肌動蛋白的表達(dá)低于 CTS 組。還發(fā)現(xiàn) shRNA-整合素 αV 或 β3 組中 β-肌動蛋白的表達(dá)低于 CTS 組。免疫熒光顯示，微絲應(yīng)力纖維在循環(huán)拉應(yīng)力作用下呈網(wǎng)狀分散在靠近細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)中。當(dāng)整合素αVβ3的表達(dá)受到抑制時，微絲應(yīng)力纖維以與GM（培養(yǎng)基）組相似的拉長方式排列。這些結(jié)果表明，循環(huán)拉伸應(yīng)力上調(diào)β-肌動蛋白的表達(dá)并通過整合素αVβ3改變肌動蛋白絲的結(jié)構(gòu)。

為了研究肌動蛋白絲是否參與由循環(huán)拉伸應(yīng)力誘導(dǎo)的成骨分化，使用細(xì)胞松弛素D 來抑制肌動蛋白絲的聚合。蛋白質(zhì)印跡顯示，在循環(huán)拉伸應(yīng)力下，細(xì)胞松弛素D降低了ALP和RUNX2的表達(dá)。這些結(jié)果表明，循環(huán)拉伸應(yīng)力通過整合素αVβ3-微絲軸調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞成骨分化的早期階段。

成骨過程中通過整合素αVβ3-微絲軸調(diào)節(jié)循環(huán)拉伸應(yīng)力核YAP

實(shí)驗(yàn)還探討了循環(huán)拉伸應(yīng)力是否通過整合素αVβ3-微絲軸調(diào)節(jié)核 YAP 的表達(dá)。蛋白質(zhì)印跡和qRT-PCR顯示核YAP的表達(dá)在循環(huán)拉伸應(yīng)力下增加。當(dāng)整合素αVβ3的表達(dá)受到抑制時，蛋白質(zhì)印跡顯示核YAP的表達(dá)低于CTS組。免疫熒光結(jié)果顯示，在循環(huán)拉應(yīng)力作用下，核YAP的表達(dá)明顯增加。此外還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)整合素 αVβ3 被抑制時，核 YAP 的表達(dá)降低。這些結(jié)果表明，循環(huán)拉伸應(yīng)力通過整合素αVβ3上調(diào)核YAP。

當(dāng)細(xì)胞松弛素D 抑制 β-肌動蛋白的聚合時，蛋白質(zhì)印跡和免疫熒光顯示核 YAP 的表達(dá)在循環(huán)拉伸應(yīng)力下降低。蛋白質(zhì)印跡還顯示，在維替泊芬存在下，在循環(huán)拉伸應(yīng)力下ALP和RUNX2的表達(dá)降低。上述實(shí)驗(yàn)表明，在成骨分化早期，循環(huán)拉伸應(yīng)力通過整合素αVβ3-微絲軸調(diào)節(jié)核YAP。

循環(huán)拉伸應(yīng)力促進(jìn)成骨過程中粘著斑的形成和 FAK 磷酸化

由肌動蛋白絲和整合素形成的粘著斑需要踝蛋白（talin）、FAK 和紐蛋白（vinculin）才能將 CTS 傳遞到基底。實(shí)驗(yàn)檢測了 talin-1、FAK 和 vinculin 的表達(dá)，以探索它們與整合素 αVβ3 的關(guān)聯(lián)。蛋白質(zhì)印跡和qRT-PCR顯示在循環(huán)拉伸應(yīng)力下talin-1、FAK和vinculin的表達(dá)增加（圖3 a、b）。蛋白質(zhì)印跡顯示，當(dāng)整合素αVβ3的表達(dá)被c（RGDyk）或shRNA抑制時，talin-1，FAK和vinculin的表達(dá)降低（圖3 c、e）。qRT-PCR 獲得了類似的結(jié)果（圖3 d、f）。免疫熒光顯示，紐蛋白在循環(huán)拉伸應(yīng)力下的可見粘著斑斑塊中表達(dá)和定位更高。整合素αVβ3的抑制與紐蛋白表達(dá)的顯著降低相關(guān)（圖3 g）。這些結(jié)果表明，循環(huán)拉伸應(yīng)力通過整合素αVβ3促進(jìn)粘著斑的形成。

接下來，研究了 FAK 磷酸化在循環(huán)拉伸應(yīng)力下在成骨分化中的作用。蛋白質(zhì)印跡顯示FAK的磷酸化響應(yīng)于循環(huán)拉伸應(yīng)力而增加，并且整合素αVβ3的抑制下調(diào)了FAK的磷酸化（圖3 h、i）。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng) FAK 的磷酸化被 Y-15（一種小分子抑制劑）抑制時，ALP 和 RUNX2 的表達(dá)降低（圖3 j）。這些結(jié)果表明，FAK不僅參與了含有整合素αVβ3的粘著斑的形成，而且FAK的磷酸化有助于循環(huán)拉伸應(yīng)力誘導(dǎo)的成骨分化的早期階段。

圖3   CTS 誘導(dǎo)的整合素 αVβ3 激活調(diào)節(jié)粘著斑相關(guān)蛋白和 FAK 的磷酸化，以促進(jìn)成骨分化的早期階段。

（a）talin-1、FAK 和 vinculin 的蛋白質(zhì)表達(dá)在 CTS 下 4 天和 7 天。（b）talin-1、FAK和vinculin mRNA表達(dá)在CTS下4天和7天。（c）GM 和 RGDyk 組中 CTS 下 talin-1、FAK 和 vinculin 的蛋白質(zhì)表達(dá)。（d）GM 和 RGDyk 組在 CTS 下 talin-1、FAK 和 vinculin 的 mRNA 表達(dá)。（e）在 CTS 下 GM、NC、shRNA-整合素αV 和 shRNA-整合素 β3 組中 talin-1、FAK 和 vinculin 的蛋白質(zhì)表達(dá)。（f）GM、NC、shRNA-整合素αV和shRNA-整合素β3組在CTS下talin-1、FAK和vinculin的mRNA表達(dá)。（g） GM、CTS、NC、shRNA-integrin αV 和 shRNA-integrin β3 組在 CTS 下的 vinculin 免疫熒光 7 天。（h） CTS 下 FAK 磷酸化水平 7 天。（i）CTS 下 GM、NC、shRNA-整合素 αV 和 shRNA-整合素 β3 組中 FAK 的磷酸化水平。（j）CTS下CTS組和Y15組ALP和RUNX2蛋白表達(dá)。

循環(huán)拉伸應(yīng)力通過整合素αVβ3的激活對成纖維細(xì)胞早期成骨分化產(chǎn)生積極影響，導(dǎo)致微絲細(xì)胞骨架的重排。此外，循環(huán)拉伸應(yīng)力刺激的肌動蛋白絲的重排和 FAK 的磷酸化通過整合素 αVβ3 導(dǎo)致人成纖維細(xì)胞中核 YAP 的表達(dá)增加。在未來的研究中，整合素αVβ3應(yīng)該被認(rèn)為是體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的一個有希望的靶點(diǎn)，以驗(yàn)證其促進(jìn)骨修復(fù)的功能。

參考文獻(xiàn)：Peng Y, Qu R, Feng Y, Huang X, Yang Y, Fan T, Sun B, Khan AU, Wu S, Dai J, Ouyang J. Regulation of the integrin αVβ3- actin filaments axis in early osteogenesis of human fibroblasts under cyclic tensile stress. Stem Cell Res Ther. 2021 Oct 7;12(1):523. doi: 10.1186/s13287-021-02597-y. PMID: 34620239; PMCID: PMC8496073.

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