細(xì)胞中的小黑點(diǎn)是如何產(chǎn)生的？如何避免？

來源：蘇州海星生物科技有限公司 2022年10月21日 17:05

在正常培養(yǎng)細(xì)胞的情況下，我們時(shí)常會(huì)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞出現(xiàn)一些小黑點(diǎn)，有些小黑點(diǎn)隨著細(xì)胞數(shù)量的增長而增長，有一些則不會(huì)，那么這些小黑點(diǎn)到底是什么？會(huì)影響細(xì)胞增長嗎？

| 細(xì)胞培養(yǎng)中出現(xiàn)的小黑點(diǎn)可以分為以下幾類：

1. 細(xì)胞碎片

在細(xì)胞培養(yǎng)中不合適操作引起的化學(xué)或物理上的刺激，例如胰酶消化時(shí)間過長，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡，從而產(chǎn)生很多碎片。

2. 凋亡小體

在體外培養(yǎng)條件下，細(xì)胞很容易受到環(huán)境改變的影響，誘發(fā)細(xì)胞的凋亡，產(chǎn)生凋亡小體。

3. 血清中的沉淀

經(jīng)過熱處理的血清中，作為常見沉淀物質(zhì)的磷酸鈣會(huì)顯著增多，且由于布朗運(yùn)動(dòng)會(huì)看上去可以活動(dòng)。

4. 支原體污染

由于支原體的污染，導(dǎo)致出現(xiàn)的小黑點(diǎn)，明顯影響細(xì)胞增長。

| 細(xì)胞培養(yǎng)過程中如何避免產(chǎn)生小黑點(diǎn)？

懸浮細(xì)胞：

收集細(xì)胞上清慢速離心（500~600 rpm/min，5~6 min）并更換新的培養(yǎng)瓶。

貼壁細(xì)胞：

將細(xì)胞用 PBS 洗 2~3 遍，洗的時(shí)候，輕輕拍打培養(yǎng)瓶，讓貼壁不牢的碎片和顆粒脫落，再棄去 PBS，消化時(shí)先加低濃度的胰酶如 0.05% 胰酶消化 1 min 左右，讓細(xì)胞間隙中的顆粒和碎片脫落下來，去掉低濃度胰酶，然后正常消化細(xì)胞，將收集的細(xì)胞懸液慢速離心（500~600 rpm/min，5~6 min）并更換新的培養(yǎng)瓶，并可以嘗試適當(dāng)增加血清濃度進(jìn)行培養(yǎng)。

如果懷疑黑點(diǎn)是支原體污染，可進(jìn)行支原體檢測(cè)，檢測(cè)陽性請(qǐng)及時(shí)將細(xì)胞處理后丟棄。比較珍貴的細(xì)胞，可以嘗試使用支原體清除劑（Hycyte™支必清支原體清除試劑盒）去除，并與其他細(xì)胞分開培養(yǎng)。

小黑點(diǎn)和微生物污染的區(qū)別
	細(xì)胞碎片/分泌物	微生物污染
形態(tài)	大小不一的黑色圓點(diǎn)，或不規(guī)則形狀	圓球狀或桿狀，形態(tài)非常規(guī)則
是否運(yùn)動(dòng)	原地震動(dòng)，布朗運(yùn)動(dòng)或相對(duì)液體靜止	快速游動(dòng)，快速轉(zhuǎn)圈或相對(duì)液體靜止
分布情況	視野中分布無規(guī)律	視野中分布均勻
增長情況	無抗生素條件下不增多或緩慢增多	無抗生素條件下48-72小時(shí)內(nèi)爆發(fā)式增多

| 注意事項(xiàng)：

1. 掌握細(xì)胞傳代的狀態(tài)較好時(shí)機(jī)，不要細(xì)胞長老了再傳代；

2. 掌握好消化時(shí)間，防止消化過度產(chǎn)生細(xì)胞碎片；

3. 減少血清等試劑的凍融次數(shù)；

4. 將培養(yǎng)液的 PH 調(diào)到好；

5. 嚴(yán)格控制水質(zhì)和器皿的清潔。

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