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熒光測定法檢測細(xì)菌內(nèi)毒素含量的方法介紹

來源:科德角國際生物醫(yī)學(xué)科技(北京)有限公司   2022年10月25日 11:10  

鱟試驗(yàn)法中,有不少方法可以檢測細(xì)菌內(nèi)毒素含量,其中一種就是熒光測定法。

那熒光測定法在試驗(yàn)中是怎么進(jìn)行操作的呢?

首先需要將熒光母素和鱟試劑充分混勻,這樣蛋白分子在進(jìn)行凝膠反應(yīng)的同時(shí),熒光素就可以將其標(biāo)記上。

 

 

在凝膠逐漸形成的過程中,蛋白分子的聚合結(jié)構(gòu)也會(huì)慢慢發(fā)生變化,與此同時(shí),與熒光素結(jié)合的蛋白因子也會(huì)跟隨水分子的運(yùn)動(dòng)從而進(jìn)行同步旋轉(zhuǎn),使得熒光的偏光度會(huì)發(fā)生變化。這時(shí),我們將熒光的偏光度設(shè)為P,垂直的熒光強(qiáng)度設(shè)為I1,水平的熒光強(qiáng)度設(shè)為I2,,然后可以看得出,P值會(huì)因?yàn)槟z的凝固程度而發(fā)生變化,這個(gè)時(shí)候想要求出其中的值,可以根據(jù)下圖公式計(jì)算得出:

 

 

根據(jù)此公式可以得出,P值和供試品中的細(xì)菌內(nèi)毒素含量為線性關(guān)系。

在進(jìn)行鱟試驗(yàn)時(shí),熒光母素的常用濃度一般為0.02%,若熒光母素的濃度超過0.05%以上,蛋白分子的聚合結(jié)構(gòu)就會(huì)受到抑制,發(fā)生明顯的變化,而熒光母素的濃度在0.025%時(shí),蛋白分子的聚合結(jié)構(gòu)會(huì)受到輕微抑制。所以,我們一般選定熒光母素的常用濃度為0.02%。

鱟試劑在凝固的過程中會(huì)隨時(shí)影響P值得變化。當(dāng)凝膠逐漸凝固時(shí),P值就會(huì)越來越大,而內(nèi)毒素的濃度又決定了鱟試劑凝固的反應(yīng)期的時(shí)間長短和P值的增大變化。

當(dāng)內(nèi)毒素值為10-2μg/ml的時(shí)候,P值就會(huì)在五分鐘內(nèi)開始產(chǎn)生增大的變化;若內(nèi)毒素值在10-3μg /ml的時(shí)候,P值在30分鐘時(shí)都不會(huì)又明顯增大的變化;又若是內(nèi)毒素值在<10-3μg /ml的時(shí)候,因內(nèi)毒素的濃度值過小,鱟試劑凝固的反應(yīng)潛伏期就會(huì)越長。這個(gè)時(shí)候就能根據(jù)P值的上升程度繪制出圖像,從而得出回歸直線方程值。

這時(shí),我們?cè)O(shè)傾斜度為b,潛伏期為,計(jì)算b/t值。根據(jù)熒光母素濃度的不同計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素的值然后繪制成曲線圖像,可以得出內(nèi)毒素含量在10-810-3μg /ml范圍時(shí),整體是呈上升直線狀的,可以得出相關(guān)系數(shù)0.9804

由此列出方程式 

Y = 0.0207 + 0.0797x,其中 (R = 0.9804)

由此標(biāo)準(zhǔn)曲線可以得出供試品中的細(xì)菌內(nèi)毒素含量

需要注意的是,熒光測定法的試驗(yàn)操作均在0℃的環(huán)境中進(jìn)行操作,在進(jìn)行60分鐘靜置時(shí),還需時(shí)刻觀察試驗(yàn)的反應(yīng)過程,然后每5分鐘就需要進(jìn)行一次測定。

總而言之,熒光測定法需謹(jǐn)慎、耐心,方可得到準(zhǔn)確的結(jié)果。

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