摘要利用安捷倫 6890N 氣相色譜串聯(lián) 5975B 質(zhì)譜和安捷倫 7000 系列三重四極桿 GC/MS 建立了對尿液中促蛋白合成類固醇代謝物長期檢測的方法。利用 GC/MS 的 SIM 模式監(jiān)測代謝物的硫酸鹽結(jié)合物，而不是常規(guī)的葡萄糖醛酸結(jié)合物，使美替諾龍（甲基雄烯醇酮）用藥后能夠被檢測到的時間延長了兩倍。使用三重四極桿 GC/MS 的 SRM 模式還可以進(jìn)一步延長檢測期限，幾乎是常規(guī)檢測葡萄糖醛酸結(jié)合物方法檢測期限的三倍。

前言促蛋白合成雄性激素類固醇 (AAS) 的非醫(yī)學(xué)使用在美國是違法的，同時也被大多數(shù)體育組織所禁止。然而，無論對于業(yè)余還是職業(yè)體育運(yùn)動來說，AAS“興feng劑”問題由來已久，并且在高中和高校競賽中日益顯現(xiàn)。1988，由于尿樣中被檢出司坦唑醇，短跑運(yùn)動員本被取消參賽資格，已經(jīng)取得的金牌和兩項世界紀(jì)錄也被取消。弗洛伊德•蘭迪斯由于在篩查試驗中被檢測到睪丸酮/表睪丸酮比偏高，因此被取消了 2006 年環(huán)法總頭銜，并被處以兩年禁賽的處罰。熟悉反興feng劑法規(guī)的違規(guī)者知道，如果在常規(guī)藥檢之前停藥時間足夠長，就可以在“訓(xùn)練時”“安全”使用而不被檢出。因此違規(guī)者精心調(diào)整最后一次使用 AAS 的時間和興feng劑檢測尿樣采集時間的間隔以確保檢測結(jié)果呈陰性。因此，AAS 的可追溯檢測是成功反興feng劑不可少的?，F(xiàn)在興feng劑檢測實驗室都在尋找能夠在停止使用后更長的時期內(nèi)檢測到 AAS 的方法。典型的尿液中促蛋白合成類固醇及其相關(guān)物質(zhì)的興feng劑檢測方法是通過氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用 (GC/MS) 進(jìn)行篩查。然而，傳統(tǒng)的分析方法只能在用藥后五天左右的時間之內(nèi)檢測到 AAS。通過使用能夠檢測到超低濃度 AAS 的儀器尋找和監(jiān)測尿液中的長期代謝物以，就可以在用藥后更長時期內(nèi)檢測到促蛋白合成類固醇 [1-3]。

本文介紹了使用安捷倫 6890N 氣相色譜串聯(lián) 5975B 質(zhì)譜和安捷倫 7000 系列三重四極桿 GC/MS 建立可以延長 AAS 檢測期限的方法。對 AAS 的代謝物 —— 硫酸鹽結(jié)合物的檢測使本方法的建立成為可能，因為 AAS 的硫酸鹽結(jié)合物比常規(guī)檢測的 AAS 代謝物在人體內(nèi)可以存在更長時間 [4, 5]。利用 6890N 氣相色譜串聯(lián)5975B 質(zhì)譜，可以將 AAS 代謝物的檢出期限延長至常規(guī) GC/MS方法的兩倍。而應(yīng)用安捷倫 7000 系三重四極桿 GC/MS 可以將AAS 代謝物的檢出期限延長至常規(guī) GC/MS 方法的三倍，并且干擾少，靈敏度高。

實驗部分標(biāo)樣及試劑實驗所用標(biāo)樣及試劑見表 1。儀器使用的 GC/MS 是配有分流/不分流毛細(xì)管進(jìn)樣口的 6890N 氣相色譜和安捷倫 5795B GC/MSD。使用的 GC/MS/MS 是配有分流/不分流毛細(xì)管進(jìn)樣口的安捷倫 7890A 氣相色譜和安捷倫 7000系三重四極桿 GC/MS。儀器條件見表 2 和表 3。

?

樣品制備經(jīng)固相萃取柱初步凈化（去除尿基質(zhì)）后，用 β-葡萄糖醛酸酶處理提取物以有效裂開葡萄糖醛酸結(jié)合物，產(chǎn)生游離類固醇?；旌衔镞^ C-18 固相萃取柱，用乙腈淋洗以去除未裂開的類固醇硫酸鹽結(jié)合物和其他污染物。然后用甲醇洗脫酶解得到的游離類固醇，衍生化后用于 GC/MS 分析。

吹干含有類固醇硫酸鹽的乙腈淋洗液，用 β-葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶水解其中含有的硫酸鹽結(jié)合物。再將水解提取物過 C-18固相萃取柱，用乙腈淋洗去除殘存的污染物。用甲醇洗脫游離類固醇，吹干，衍生化后用于 GC/MS 分析。樣品吹干，然后溶解在 100 µL N-甲基-N-(三甲基硅烷)三氟乙酰an (MSFTA)- NH4I-乙硫醇 (100:2:3, v/w/v) 中，并在 65 °C 下衍生 15 min [3]。

分析參數(shù)不同 AAS 代謝物的 GC/MS 分析參數(shù)見表 4，三重四極桿 GC/MS參數(shù)見表 5。

結(jié)果類固醇代謝物的長期檢測促蛋白合成類固醇及其代謝物以葡糖醛酸或硫酸鹽結(jié)合物的形式隨尿液排出體外，在分析之前首先要將類固醇解離。目前來源于大腸桿菌的 β-葡萄糖醛酸酶，經(jīng)常被用在興feng劑檢測的常規(guī)類固醇分析中。然而，該酶不能裂開類固醇的硫酸鹽結(jié)合物，因此在常規(guī)檢查中以硫酸鹽結(jié)合物形式存在的類固醇是“不可見”的。由于尿液中硫酸鹽結(jié)合物比葡萄糖醛酸結(jié)合物存在時間長，所以如果某種方法能夠使硫酸鹽結(jié)合物“可視化”就能夠?qū)崿F(xiàn)類固醇的長期檢測。使用 β-葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶和選擇性提取步驟可以將促蛋白合成類固醇及其代謝物從硫酸鹽結(jié)合物中釋放出來。從尿樣提取液的色譜圖結(jié)果中可以看出，使用常規(guī)的 GC/MS 選擇離子監(jiān)測(SIM) 模式進(jìn)行測定，可得到美替諾龍代謝物的葡萄糖醛酸和硫酸鹽結(jié)合物分離的色譜圖（圖 1）。圖 1 中下方的葡萄糖醛酸部分的色譜圖顯示了 3α-羥基代謝物及其母體結(jié)合物（17β-羥基）的存在。這兩個化合物在興feng劑檢測中通常是常規(guī)篩查和步驟確證的目標(biāo)物。圖 1 中上方顯示了硫酸鹽提取物的色譜圖，其中用紅色標(biāo)出的代謝物與 16-羥基 3,17-二酮結(jié)構(gòu)相匹配。在這種情況下，18% 的羥孕酮代謝物是與葡萄糖醛酸相結(jié)合的（下方色譜圖中 6.9 分鐘時的紅色峰）。而占 82% 的大部分的羥孕酮代謝物以硫酸鹽結(jié)合物的形式被排出體外（上方色譜圖）。通常，尿液中美替諾龍代謝物的葡萄糖醛酸目標(biāo)物只能在口服藥物后五天以內(nèi)檢測到。而美替諾龍的羥孕酮硫酸鹽結(jié)合物可以用常規(guī)的 GC/MS 在口服后至少 9 天內(nèi)檢測到。硫酸鹽結(jié)合的 16-羥基-3,17-二酮代謝物是 A 環(huán)中含有甲基的促蛋白合成類固醇中普遍存在的主要代謝物，包括司騰勃龍、羥甲雄酮和甲二氫睪酮（數(shù)據(jù)未列出）。

結(jié)論通過監(jiān)測硫酸鹽結(jié)合代謝物，而不是其葡萄糖醛酸結(jié)合代謝物，可以顯著延長促蛋白合成類固醇的檢測期限。使用選擇性提取步驟和 β-葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶可以將促蛋白合成類固醇代謝物從其硫酸鹽結(jié)合物中釋放出來，備衍生化和 GC/MS 分析使用。該步驟使用 GC/MS SIM 模式分析可以使某些促蛋白合成類固醇的檢測期限由 5 天延長到 9 天，幾乎是原來的兩倍。在三重四極桿 GC/MS 聯(lián)用儀上使用 SRM 模式，取出了基質(zhì)干擾，可以將美替諾龍的檢測期限由 9 天延長到 14 天。該系統(tǒng)還可以分析一些不易用傳統(tǒng) GC/MS SIM 模式進(jìn)行分析的類固醇。因此，對于促蛋白合成類固醇的長期檢測，三重四極桿 GC/MS 是傳統(tǒng)GC/MS SIM 模式的一種較好的替代方法。