● 研 究 難 點(diǎn)

膜蛋白難以純化，需要用去垢劑溶解，但有效提取膜蛋白的去垢劑不一定適宜純化及下游的生化實(shí)驗(yàn)，需要快速且高通量篩選去垢劑的方法。

歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的研究人員利用nanoDSF和Backreflection技術(shù)開發(fā)了一套膜蛋白的高通量篩選去垢劑的流程。

首先他們使用常用去垢劑DDM把蛋白提取出來，接下來將待篩選的去垢劑預(yù)裝至96孔板中，把提取出來的蛋白直接進(jìn)行稀釋，孵育一小時(shí)后使用蛋白穩(wěn)定性分析儀Promethus檢測(cè)蛋白的Tm與Tagg值。根據(jù)檢測(cè)到的數(shù)據(jù)，研究人員制作出熱圖，圖中深綠色的條件代表目標(biāo)膜蛋白在該去垢劑中Tm與Tagg值較高，狀態(tài)接近于天然的構(gòu)象，而紅色則代表該去垢劑會(huì)使目標(biāo)膜蛋白變性。

使用脂質(zhì)立方相(LCP)這一種類膜環(huán)境中結(jié)晶膜蛋白，由于LCP的粘稠性以及相行為，使用基于染料的DSF或DSC的方法來評(píng)估蛋白的穩(wěn)定性基本是不可行的。

使用LCP的結(jié)晶方法需要篩選不同的脂質(zhì)和添加物，把每個(gè)LCP組成條件放在許多不同的沉淀劑緩沖液中試驗(yàn)結(jié)晶。為了找到良好的LCP條件，zui大限度地提高膜蛋白的穩(wěn)定性，以減少不同結(jié)晶試驗(yàn)的次數(shù)，愛爾蘭科學(xué)家使用Promethus蛋白穩(wěn)定性分析儀進(jìn)行了脂立方相中的膜蛋白穩(wěn)定性檢測(cè)，并建立了一套方法學(xué)，用來快速篩選膜蛋白介觀結(jié)晶的LCP條件。

以膜蛋白LntEco為例，研究人員首先檢測(cè)了它在9.9 MAG制備的LCP中的熱變性曲線和聚集曲線，然后在脂立方相中進(jìn)行了與結(jié)晶相關(guān)的多種處理，包括使用不同的脂質(zhì)主體、附加脂質(zhì)體和配體，再用nanoDSF技術(shù)檢測(cè)得到其Tm值的變化，以反映出該種處理方法對(duì)LntEco的熱穩(wěn)定性的影響。這一系列的測(cè)試也證明了無標(biāo)記的nanoDSF技術(shù)能夠在非常粘稠的LCP中測(cè)量膜蛋白的穩(wěn)定性，幫助研究人員在膜蛋白結(jié)晶試驗(yàn)之前篩選LCP的條件。

在表征膜蛋白功能時(shí)，需要在類膜的環(huán)境中保持它的天然結(jié)構(gòu)和功能

Nanodiscs可使膜蛋白處于類似磷脂雙分子層的環(huán)境中，從而模擬膜蛋白在細(xì)胞膜中的構(gòu)象和生物學(xué)功能；因此, Nanodiscs在膜蛋白領(lǐng)域的研究工作起到很大的作用。

2020年，德國(guó)工業(yè)大學(xué)的研究人員就利用了Nanodisc這一工具研究了甘氨酸受體 (GlyR) 在類膜環(huán)境中表現(xiàn)出的配體特異性的構(gòu)象變化（圖a），并通過NanoTemper公司的Monolith分子互作儀檢測(cè)了GlyR與其激動(dòng)劑的相互作用。

為了分析GlyR隨著完quan激動(dòng)劑glycine的濃度改變而產(chǎn)生的構(gòu)象變化，研究人員以Nanodisc溶解的His-GlyR純化蛋白作為target，glycine作為ligand進(jìn)行了MST實(shí)驗(yàn)，得到EC50= 65 ± 22.8 μM（圖b），這與通過電生理學(xué)方法獲得的表觀EC50值相似。

接下來，研究人員以GlyR與不完quan激動(dòng)劑taurine的相互作用為研究對(duì)象，對(duì)比了完quan和不完quan激動(dòng)劑所產(chǎn)生的MST信號(hào)差異。在這次實(shí)驗(yàn)中，研究人員使用卵母細(xì)胞表達(dá)GlyR-GFP蛋白，并以加入Nanodiscs的細(xì)胞裂解液溶作為target直接進(jìn)行檢測(cè)，無需純化GlyR蛋白。結(jié)果顯示GlyR與taurine 結(jié)合的EC50 = 473.8 ± 46.1 μM，親和力小于Glycine，與預(yù)期一致（圖c）。以此數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，研究人員推導(dǎo)出由兩種激動(dòng)劑引起的GlyR構(gòu)象變化模型。

這項(xiàng)研究揭示了GlyR由特定激動(dòng)劑誘導(dǎo)的構(gòu)象特征，和在自然環(huán)境中配體結(jié)合決定受體激活的機(jī)制。對(duì)于低豐度且難以純化和固定的膜蛋白，Monolith分子互作檢測(cè)儀可以實(shí)現(xiàn)免純化檢測(cè)，直接得到膜蛋白在細(xì)胞裂解液中與配體的親和力，在保證膜蛋白處于天然環(huán)境中，最da程度維持其構(gòu)象和功能的同時(shí)節(jié)省您制備樣品的時(shí)間。

（圖a）Nanodiscs中的GlyR 示意圖