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應用文集|完整蛋白質(zhì)和亞基純度“柱”力提高生物制藥關(guān)鍵質(zhì)量屬性

來源:安捷倫科技(中國)有限公司   2022年11月23日 12:00  

反相色譜仍然是色譜工作者“武器庫”中最有價值的工具之一。這是一種廣為人知的技術(shù),依賴于分析物和固定相之間的疏水相互作用。對于完整蛋白質(zhì),該技術(shù)使用有機溶劑梯度作為流動相,通常使用離子對試劑。在這些條件下,分子很可能發(fā)生變性。這是一種靈敏的分析技術(shù),因為樣品保留在色譜柱上得到濃縮,且適用于質(zhì)譜分析。因此,該技術(shù)適用于測定完整蛋白質(zhì)的精確質(zhì)量。


對于大分子蛋白質(zhì)(例如單克隆抗體),甚至對于較小的片段(例如重鏈和輕鏈或 IgG 分子的 Fab 和 Fc 區(qū)域),推薦使用大孔徑色譜柱。安捷倫能夠提供多種配置的 300 ? 和 450 ? 產(chǎn)品,包括全多孔、采用表面多孔顆粒的 Poroshell 技術(shù)以及一系列烷基鍵合相。鍵合相通常具有較短的碳鏈長度(C8 或 C4/C3)或具有更多獨特的配體,例如可提供不同選擇性的二苯基。由于反相色譜分析準確度高,因此可以使用完整蛋白質(zhì)和片段分析來比較生物治療藥物的生物仿制藥與原研藥。然而,始終需要執(zhí)行額外的測試以鑒定可能檢出的不同異構(gòu)體的具體位置。


色譜柱選擇


選擇用于完整蛋白質(zhì)分析的反相色譜柱時需要考慮多個相互關(guān)聯(lián)的因素:樣品分子量和最適合的填料孔徑,色譜柱固定相,所用的儀器(特別是檢測器的類型),流動相條件,以及速度或通量要求等。


分析物分子越大,則需要越大的孔徑。除一些例外情況,用于完整蛋白質(zhì)分析的孔徑通常為 300–500 ?。根據(jù)經(jīng)驗,孔徑至少應為蛋白質(zhì)流體動力學半徑的三倍。AdvanceBio RP-mAb 色譜柱具有 450 ? 的孔徑,ZORBAX RRHD 300 ?、ZORBAX 300SB 和 Poroshell 300 均具有 300 ? 的孔徑,而 PLRP-S 提供多種孔徑。雖然 1000 ? 的 5 µm PLRP-S 色譜柱孔徑明顯大于常用于完整蛋白質(zhì)分析的色譜柱,但是該色譜柱可為完整蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)片段分析提供優(yōu)異的結(jié)果。


對于反相色譜柱,選擇色譜柱固定相的通用指南是,分子量越大,使用的烷基鏈應越短。因此,C18 色譜柱常用于多肽分析,而 C8、C4 和 C3 色譜柱常用于完整蛋白質(zhì)分離。除線性烷基鏈以外,AdvanceBio RP-mAb、ZORBAX RRHD 300 和 ZORBAX 300SB 色譜柱可提供二苯基固定相。有時,二苯基固定相的不同選擇性可提供所需的分離。PLRP-S 是一種聚合物填料而不是硅膠基填料。它提供典型的反相分離以及略有不同的選擇性和寬 pH 耐受性。


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此外,本篇應用文集中還包含 AdvanceBio RP mAb、PLRP-S、AdvanceBio HIC、ZORBAX RRHD 300SB 等應用簡報供您查閱,為生物治療藥物關(guān)鍵質(zhì)量屬性提供新方法,新思路。

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