蛋白酶K來源于林伯氏白色念球菌(Tritirachium album Limber),是一種與枯草桿菌蛋白酶相關(guān)的絲氨酸蛋白酶。由于它能降解角蛋白(keratin),因此被命名為蛋白酶K。它是一種高活性的廣譜蛋白酶,在變性劑尿素或十二烷基磺酸鈉(sodium dodecyl sulfonate,SDS)溶液中依然能保持較高酶活力,所以被廣泛應(yīng)用于各種生物材料中的DNA或RNA的提取。
蛋白酶K的性質(zhì)從這三個方面介紹:
一、分子結(jié)構(gòu)
蛋白酶K由一條肽鏈組成,包含277個氨基酸殘基,相對分子質(zhì)量為28 930?;钚圆课挥蒁39、H69和S224組成,底物識別位點主要為G100-Y104和S132-G136兩個片段。蛋白酶K的氨基酸序列與枯草芽孢桿菌蛋白酶具有高度同源性,因此被劃分為枯草芽孢桿菌蛋白酶類。蛋白酶K包含兩個二硫鍵(C34-C124,C179-C248),兩個色氨酸殘基(W8,W212)和一個游離半胱氨酸(C73)。X射線晶體學(xué)研究表明,蛋白酶K的三維結(jié)構(gòu)為一個明確的球形折疊。蛋白酶K屬于α/β類蛋白質(zhì),包含6個α-螺旋,15個β-折疊和一個3/10螺旋。
二、熒光性
蛋白酶K在295 nm處被激發(fā),它的熒光性由兩個色氨酸殘基W8和W212決定。但是,兩個色氨酸的光反應(yīng)活性表現(xiàn)不同,W212要活潑得多。在pH 3~9范圍內(nèi),色氨酸熒光量子產(chǎn)率恒定。對已激發(fā)的色氨酸進行熱力滅活時,活化能需達到54 kJ/mol。這個值大幅地高于來自微生物的其他蛋白酶,因此可用來解釋蛋白酶K較高的熱穩(wěn)定性。
三、酶學(xué)性質(zhì)
蛋白酶K具有很高的切割活性,底物識別位點能和底物組成一個3股的反平行β片層,可催化脂肪族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽鍵斷裂。α-螺旋是保持蛋白酶K活性中心構(gòu)象穩(wěn)定性的主要結(jié)構(gòu)。α-螺旋共包含90個氨基酸殘基,占殘基總數(shù)的1/3,大部分殘基處在伸展的β-折疊結(jié)構(gòu)中。這使得整個分子有序度低,變性熵不大,比變性焓值極低,反映了酶穩(wěn)定性的本質(zhì)。分子中兩個二硫鍵及兩個Ca2+也對三級結(jié)構(gòu)的熱穩(wěn)定性有貢獻。pH、溫度、Ca2+、激活劑和抑制劑等是影響蛋白酶K活力的主要因素。
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