由于環(huán)境條件沒有控制好和操作不當等原因，細胞培養(yǎng)中?？砂l(fā)生細菌和霉菌的污染。常見污染的細菌有：革蘭氏陰性菌，如大腸埃希菌、枯草桿菌、假單胞菌等；革蘭氏陽性菌有葡萄球菌等。真菌污染在炎熱潮濕的季節(jié)?？砂l(fā)生，如煙曲霉菌、黑曲霉、毛霉菌、孢子苗等。霉菌和細菌生長迅速，能在短時間內抑制細胞生長或殺死細胞，鏡下可見胞漿內出現(xiàn)大量顆粒，細胞變圓或崩潰從壁上脫落。對于污染的觀察，霉菌污染易于發(fā)現(xiàn)，肉眼可見白色或淺黃色菌團漂浮于培養(yǎng)液表面，有的散在生長，鏡下可見絲狀菌絲，縱橫交錯于細胞之間。而細菌污染較重時可見培養(yǎng)基上清渾濁，較輕時鏡下可見小的菌體在細胞間運動，同時可涂片染色鏡檢或進行培養(yǎng)及培養(yǎng)加以確定。
目前細胞培養(yǎng)過程中最主要的問題就是污染，污染可導致細胞的死亡，使其作為科研的原料不可再用，造成人力、財力和實踐的損失，因此一定要盡量避免污染的發(fā)生。一般可從以下三個途徑來控制污染的發(fā)生：
細胞培養(yǎng)室內應相對封閉，潔凈無塵，設有緩沖間。細胞培養(yǎng)間配備槍式移液器、手術器械、離心機、冰箱等專用儀器設備以及專用的實驗服和拖鞋，定期消毒。專用物品只在培養(yǎng)間內使用，不得帶出培養(yǎng)間。培養(yǎng)間和緩沖間每周全面清潔消毒一次。
工作中要特別注意防止培養(yǎng)液和血清的污染。培養(yǎng)細胞所用的血清必須儲存于-20至-70℃，但也不能超過一個月，解凍時在4℃冰箱溶解一天，至室溫下全溶后再分裝，在溶解過程中要規(guī)則搖晃均勻，使溫度與成分均一，這樣可以減少沉淀。不要直接在37℃解凍，因溫度改變太大，容易造成蛋白質凝結而發(fā)生沉淀。
有很多污染的發(fā)生都與操作不當有關，而細胞培養(yǎng)試驗的操作應是嚴格的無菌操作。首先試驗進行前，無菌操作臺面、廢液缸及實驗用品均應用紫外燈照射30-60分鐘滅菌；以75%酒精擦拭無菌操作臺面，并開啟無菌操作臺風扇運轉10分鐘后方可開始實驗操作。在無菌操作臺進行實驗前須戴一次性乳膠手套，并用75%酒精擦拭。
實驗用品及試劑瓶應以75%酒精擦拭后才能帶入無菌操作臺內。實驗操作應在臺面的中無菌區(qū)域；不能在打開的容器的正上方操作實驗；移液時吸量管口不要觸碰細胞培養(yǎng)皿；試劑瓶及培養(yǎng)瓶關蓋時要先在酒精燈上轉圈灼燒瓶口片刻，以防止試劑的污染。在培養(yǎng)超過一種的細胞時，還要防止不同細胞間的交叉污染。
對實驗人員的要求：實驗人員進培養(yǎng)間之前，須先洗手，在緩沖間換穿專用實驗服和拖鞋，準備好與細胞培養(yǎng)操作實驗有關的所有試劑和用品，嚴禁在實驗進行時頻繁出入培養(yǎng)間。要求實驗人員規(guī)范操作，嚴格遵守無菌工作流程。做完實驗后應將實驗產生的廢物和廢液及時移出培養(yǎng)間，并清潔無菌工作臺面。
細胞培養(yǎng)中常見最難發(fā)現(xiàn)的一種污染是支原體污染，針對支源體污染，海星生物推出的支必清支原體清除試劑盒，經驗證，可有效去除萊氏無膽甾原體（Acholeplasmalaidlawii）、精氨酸支原體（Mycoplasmaarginini）、豬鼻支原體（Mycoplasmahyorhinis）和口腔支原體（Mycoplasmaorale）等支原體。在動物細胞培養(yǎng)中，這些支原體菌株占污染的85%以上。支原體污染驗證的細胞株常會出現(xiàn)大量黑色顆粒，稱為黑膠蟲。
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