淺析熒光素標(biāo)記的生物素操作步驟

來(lái)源：北京博奧森生物技術(shù)有限公司 2022年12月09日 13:58

　　(一)獲得目的基因

　　1、通過(guò)PCR方法：以含目的基因的克隆質(zhì)粒為模板，按基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物(在上游和下游引物分別引入不同的酶切位點(diǎn))，PCR循環(huán)獲得所需基因片段。

　　2、通過(guò)RT-PCR方法：用TRIzol法從細(xì)胞或組織中提取總RNA，以mRNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA第一鏈，以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR循環(huán)獲得產(chǎn)物。

　　(二)構(gòu)建重組表達(dá)載體

　　1、熒光素標(biāo)記的生物素載體酶切：將表達(dá)質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶(同引物的酶切位點(diǎn))進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物行瓊脂糖電泳后，用膠回收Kit或凍融法回收載體大片段。

　　2、PCR產(chǎn)物雙酶切后回收，在T4DNA連接酶作用下連接入載體。

　　(三)獲得含重組表達(dá)質(zhì)粒的表達(dá)菌種

　　1、將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，根據(jù)重組載體的標(biāo)志(抗Amp或藍(lán)白斑)作篩選，挑取單斑，堿裂解法小量抽提質(zhì)粒，雙酶切初步鑒定。

　　2、測(cè)序驗(yàn)證目的基因的插入方向及閱讀框架均正確，進(jìn)入下步操作。否則應(yīng)篩選更多克隆，重復(fù)亞克隆或亞克隆至不同酶切位點(diǎn)。

　　3、以此重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌的感受態(tài)細(xì)胞。

　　(四)誘導(dǎo)表達(dá)

　　1、熒光素標(biāo)記的生物素挑取含重組質(zhì)粒的菌體單斑至2mlLB(含Amp50μg/ml)中37℃過(guò)夜培養(yǎng)。

　　2、按1∶50比例稀釋過(guò)夜菌，一般將1ml菌加入到含50mlLB培養(yǎng)基的300ml培養(yǎng)瓶中，37℃震蕩培養(yǎng)至OD600≌0.4-1.0(*0.6，大約需3hr)。

　　3、取部分液體作為未誘導(dǎo)的對(duì)照組，余下的加入IPTG誘導(dǎo)劑至終濃度0.4mM作為實(shí)驗(yàn)組，兩組繼續(xù)37℃震蕩培養(yǎng)3hr。

　　4、分別取菌體1ml，離心12000g×30s收獲沉淀，用100μl1%SDS重懸，混勻，70℃10min。

　　5、離心12000g×1min，取上清作為樣品，可做SDS-PAGE等分析。

相關(guān)產(chǎn)品

凡本網(wǎng)注明“來(lái)源：化工儀器網(wǎng)”的所有作品，均為浙江興旺寶明通網(wǎng)絡(luò)有限公司-化工儀器網(wǎng)合法擁有版權(quán)或有權(quán)使用的作品，未經(jīng)本網(wǎng)授權(quán)不得轉(zhuǎn)載、摘編或利用其它方式使用上述作品。已經(jīng)本網(wǎng)授權(quán)使用作品的，應(yīng)在授權(quán)范圍內(nèi)使用，并注明“來(lái)源：化工儀器網(wǎng)”。違反上述聲明者，本網(wǎng)將追究其相關(guān)法律責(zé)任。
本網(wǎng)轉(zhuǎn)載并注明自其他來(lái)源（非化工儀器網(wǎng)）的作品，目的在于傳遞更多信息，并不代表本網(wǎng)贊同其觀點(diǎn)和對(duì)其真實(shí)性負(fù)責(zé)，不承擔(dān)此類作品侵權(quán)行為的直接責(zé)任及連帶責(zé)任。其他媒體、網(wǎng)站或個(gè)人從本網(wǎng)轉(zhuǎn)載時(shí)，必須保留本網(wǎng)注明的作品第一來(lái)源，并自負(fù)版權(quán)等法律責(zé)任。
如涉及作品內(nèi)容、版權(quán)等問(wèn)題，請(qǐng)?jiān)谧髌钒l(fā)表之日起一周內(nèi)與本網(wǎng)聯(lián)系，否則視為放棄相關(guān)權(quán)利。

国产精品视频一区二区三区四,亚洲av美洲av综合av,99国内精品久久久久久久,欧美电影一区二区三区电影