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淺析熒光素標記的生物素操作步驟

來源:北京博奧森生物技術有限公司   2022年12月09日 13:58  
  (一)獲得目的基因
  1、通過PCR方法:以含目的基因的克隆質粒為模板,按基因序列設計一對引物(在上游和下游引物分別引入不同的酶切位點),PCR循環(huán)獲得所需基因片段。
  2、通過RT-PCR方法:用TRIzol法從細胞或組織中提取總RNA,以mRNA為模板,逆轉錄形成cDNA第一鏈,以逆轉錄產(chǎn)物為模板進行PCR循環(huán)獲得產(chǎn)物。
  (二)構建重組表達載體
  1、熒光素標記的生物素載體酶切:將表達質粒用限制性內切酶(同引物的酶切位點)進行雙酶切,酶切產(chǎn)物行瓊脂糖電泳后,用膠回收Kit或凍融法回收載體大片段。
  2、PCR產(chǎn)物雙酶切后回收,在T4DNA連接酶作用下連接入載體。
  (三)獲得含重組表達質粒的表達菌種
  1、將連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌DH5α,根據(jù)重組載體的標志(抗Amp或藍白斑)作篩選,挑取單斑,堿裂解法小量抽提質粒,雙酶切初步鑒定。
  2、測序驗證目的基因的插入方向及閱讀框架均正確,進入下步操作。否則應篩選更多克隆,重復亞克隆或亞克隆至不同酶切位點。
  3、以此重組質粒DNA轉化表達宿主菌的感受態(tài)細胞。
  (四)誘導表達
  1、熒光素標記的生物素挑取含重組質粒的菌體單斑至2mlLB(含Amp50μg/ml)中37℃過夜培養(yǎng)。
  2、按1∶50比例稀釋過夜菌,一般將1ml菌加入到含50mlLB培養(yǎng)基的300ml培養(yǎng)瓶中,37℃震蕩培養(yǎng)至OD600≌0.4-1.0(*0.6,大約需3hr)。
  3、取部分液體作為未誘導的對照組,余下的加入IPTG誘導劑至終濃度0.4mM作為實驗組,兩組繼續(xù)37℃震蕩培養(yǎng)3hr。
  4、分別取菌體1ml,離心12000g×30s收獲沉淀,用100μl1%SDS重懸,混勻,70℃10min。
  5、離心12000g×1min,取上清作為樣品,可做SDS-PAGE等分析。

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