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蛋白標(biāo)記的這些技術(shù)，都學(xué)會(huì)了嗎？
目前有多種蛋白標(biāo)記技術(shù)來幫助我們研究感興趣的蛋白質(zhì)的豐度、位置、相互作用、翻譯后修飾、功能，乃至監(jiān)測活細(xì)胞中的蛋白質(zhì)運(yùn)輸?shù)葐栴}。目前有多種類型的標(biāo)記物和標(biāo)記方式可供選擇，但是針對特定的應(yīng)用應(yīng)當(dāng)選擇適合的標(biāo)記策略。
代謝標(biāo)記策略
代謝標(biāo)記策略是一種體內(nèi)標(biāo)記方法，在這種方法中，細(xì)胞被“喂養(yǎng)”了化學(xué)標(biāo)記的營養(yǎng)物，然后這些標(biāo)記物被摻入新合成的蛋白質(zhì)、核酸或代謝物中。然后，我們可以收集細(xì)胞并分離這些分子以獲得細(xì)胞生物過程的全局視圖。
蛋白同位素標(biāo)記
原理：蛋白同位素標(biāo)記是一種經(jīng)典的蛋白示蹤和蛋白組學(xué)定量技術(shù)，用天然同位素（輕型）或穩(wěn)定同位素（重型）標(biāo)記的必需氨基酸取代細(xì)胞培養(yǎng)基中相應(yīng)氨基酸，這樣細(xì)胞新合成的蛋白質(zhì)可以在細(xì)胞生長期間通過摻入含有不同同位素的氨基酸進(jìn)行標(biāo)記。
應(yīng)用舉例：蛋白質(zhì)組學(xué)研究方向流行的代謝標(biāo)記方法是SILAC（Stable Isotope Labeling with Amino acids in Cell culture），即細(xì)胞培養(yǎng)中氨基酸的穩(wěn)定同位素標(biāo)記。結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)，SILAC通過使用重型氨基酸（例如，15N-或13C-賴氨酸）標(biāo)記其中一組培養(yǎng)物或細(xì)胞系，而向另一組添加正常的輕型氨基酸，從而量化兩種培養(yǎng)物或細(xì)胞系之間蛋白質(zhì)豐度的差異。然后將在這兩種條件下生長的細(xì)胞的裂解蛋白按細(xì)胞數(shù)或蛋白量等比例混合，經(jīng)分離、純化后進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，根據(jù)一級(jí)質(zhì)譜圖中兩個(gè)同位素型肽段的面積比較進(jìn)行相對定量，得到兩種條件下蛋白質(zhì)豐度差異的相對評估。
其他蛋白質(zhì)代謝標(biāo)記物
原理：如果不具備質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)條件，那么可以使用基于生物正交反應(yīng)的代謝標(biāo)記方法。在生物正交系統(tǒng)中，細(xì)胞被“喂食”標(biāo)記有一些對天然生物反應(yīng)基團(tuán)無反應(yīng)的化學(xué)基團(tuán)的分子結(jié)構(gòu)單元。添加含有該基團(tuán)的反應(yīng)配偶體的外源性化合物引發(fā)化學(xué)反應(yīng)，將標(biāo)記的生物分子偶聯(lián)至所需的官能團(tuán)。
應(yīng)用舉例：用含有疊氮基團(tuán)的結(jié)構(gòu)單元“喂養(yǎng)”細(xì)胞，然后在實(shí)驗(yàn)后用含有磷化H基團(tuán)的試劑進(jìn)行處理，疊氮化物和-PH2基團(tuán)通過Staudinger連接反應(yīng)偶聯(lián)，疊氮化物和膦基團(tuán)通常不存在于生物系統(tǒng)中，因此這些分子是惰性的。
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