主動(dòng)脈瓣鈣化疾病（CAVD）是老年人常見(jiàn)的瓣膜疾病，其病理特征包括瓣葉炎癥、纖維化和鈣化。瓣葉慢性炎癥、進(jìn)行性鈣化和纖維化導(dǎo)致瓣膜功能障礙，最終導(dǎo)致主動(dòng)脈瓣狹窄和心力衰竭。

越來(lái)越多的證據(jù)表明，瓣膜炎癥是促進(jìn)CAVD進(jìn)展的重要起始事件。據(jù)報(bào)道，主動(dòng)脈瓣膜的慢性炎性浸潤(rùn)與幾種瓣膜病理變化有關(guān)，包括纖維化和鈣化。此外，研究發(fā)現(xiàn)了促炎介質(zhì)（如IL-1β和TNF-α）在主動(dòng)脈瓣組織中的表達(dá)。鈣化性主動(dòng)脈瓣狹窄患者的主動(dòng)脈瓣的組織學(xué)檢查顯示，浸潤(rùn)包括單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞和肥大細(xì)胞，存在慢性炎癥過(guò)程。此外，主動(dòng)脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞（AVICs）是在維持瓣膜穩(wěn)態(tài)中起重要作用的主要結(jié)構(gòu)和功能細(xì)胞，已被發(fā)現(xiàn)積極參與CAVD發(fā)病機(jī)制中的瓣膜炎癥、纖維化和鈣化。研究 AVIC 炎癥過(guò)程的潛在機(jī)制可為了解 CAVD 發(fā)病機(jī)制和抑制 CAVD 進(jìn)展提供重要信息。

浸潤(rùn)的單核細(xì)胞產(chǎn)生炎癥介質(zhì)，在炎癥部位分化為促炎巨噬細(xì)胞。這些細(xì)胞能夠通過(guò)釋放促炎因子（旁分泌）和/或直接的細(xì)胞間相互作用來(lái)影響附近的細(xì)胞。在患病的主動(dòng)脈瓣組織中可以觀察到單核細(xì)胞浸潤(rùn)、巨噬細(xì)胞積聚和促炎細(xì)胞因子水平升高。之前的研究發(fā)現(xiàn)，激活的單核細(xì)胞能夠通過(guò)旁分泌信號(hào)使人類AVIC對(duì)炎癥反應(yīng)敏感。目前，關(guān)于單核細(xì)胞與AVIC的直接相互作用以及這種相互作用對(duì)AVIC炎癥活性和瓣膜炎癥的影響知之甚少。

可溶性細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）蛋白能夠作為損傷相關(guān)分子模式（DAMPs）發(fā)揮作用。組織損傷或ECM降解后，隨著可溶性ECM蛋白的釋放產(chǎn)生DAMPs。細(xì)胞與可溶性ECM蛋白的相互作用傳遞信號(hào)以啟動(dòng)AVIC中的生物活性。Matrilin-2是Matrilin家族中結(jié)締組織分布廣泛的主要成員，組織損傷或應(yīng)激過(guò)程中可溶性Matrilin-2可用作信號(hào)分子。此外，據(jù)報(bào)道，Matrilin-2與炎癥相關(guān)的病理生物學(xué)過(guò)程有關(guān)。研究表明，Matrilin-2可以作為DAMPs，刺激人類AVICs產(chǎn)生炎癥反應(yīng)并且增強(qiáng)其成骨分化活性。目前尚不清楚Matrilin-2是否激活單核細(xì)胞，以及單核細(xì)胞是否影響AVIC對(duì)Matrilin-2的炎癥反應(yīng)。

在炎癥刺激下，白細(xì)胞被募集到炎癥區(qū)域，并通過(guò)細(xì)胞粘附分子與組織常駐細(xì)胞相互作用。細(xì)胞間粘附分子（ICAM）-1是免疫球蛋白（Ig）樣細(xì)胞粘附分子超家族的成員。它在心血管細(xì)胞表面上構(gòu)成性表達(dá)并在炎癥狀態(tài)下表達(dá)水平上調(diào)。整合素是一類糖基化的異二聚體跨膜型粘附受體。β2-整合素在白細(xì)胞表面表達(dá)，作為必需的粘附分子起作用。它介導(dǎo)白細(xì)胞粘附到不同細(xì)胞。已發(fā)現(xiàn)ICAM-1具有受體的功能，可以與白細(xì)胞上的β2-整合素相互作用，以調(diào)節(jié)白細(xì)胞在炎癥部位的遷移和粘附。此外，β2-整合素可作為ICAM-1的配體，誘導(dǎo)依賴于ICAM-1的效應(yīng)細(xì)胞活化。因此，單核細(xì)胞極有可能通過(guò)β2-整合素/ICAM-1 之間的聯(lián)結(jié)與 AVICs 相互作用以調(diào)節(jié)AVICs 對(duì)促炎刺激的炎癥反應(yīng)。

基于此，美國(guó)科羅拉多大學(xué)丹佛分校外科系、南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院心內(nèi)科的一項(xiàng)聯(lián)合研究旨在確定：（1）可溶性ECM蛋白對(duì)單核細(xì)胞粘附到人AVICs的影響，（2）單核細(xì)胞-AVIC相互作用對(duì)AVICs對(duì) Matrilin-2 的炎癥反應(yīng)的影響，（3）單核細(xì)胞對(duì)AVICs施加影響的機(jī)制和（4）負(fù)責(zé)從單核細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)信息的AVIC信號(hào)通路。

單核細(xì)胞增強(qiáng)AVICs對(duì)可溶性ECM蛋白的炎癥反應(yīng)

為了確定可溶性ECM蛋白對(duì)與THP-1單核細(xì)胞共培養(yǎng)的人AVICs炎癥反應(yīng)的影響，實(shí)驗(yàn)將單培養(yǎng)的AVICs和與THP-1單核細(xì)胞共培養(yǎng)的AVICs暴露于增加濃度的Matrilin-2（0，1，2或4 μg/ mL）中48小時(shí)。圖1 A顯示，在AVIC 單培養(yǎng)中，Matrilin-2劑量依賴性地增加了ICAM-1和IL-6水平。有趣的是，Matrilin-2在單核細(xì)胞-AVIC共培養(yǎng)中誘導(dǎo)了ICAM-1和IL-6水平的更大增加，特別是在暴露于低濃度Matrilin-2（1 μg/mL）的共培養(yǎng)物中。共培養(yǎng)中ICAM-1和IL-6的產(chǎn)生主要由AVICs產(chǎn)生，因?yàn)闇y(cè)試濃度中的Matrilin-2對(duì)單核細(xì)胞中的ICAM-1和IL-6水平?jīng)]有影響（圖1 B）。此外，用低濃度的Matrilin-2（1 μg/mL）刺激共培養(yǎng)物以時(shí)間依賴性方式增強(qiáng)了AVICs 中 ICAM-1和IL-6的產(chǎn)生，在測(cè)試時(shí)間點(diǎn)的48小時(shí)時(shí)效果最大（圖1 C）。這些觀察結(jié)果表明，單核細(xì)胞增強(qiáng)AVICs對(duì)可溶性ECM蛋白的炎癥反應(yīng)。

圖1   單核細(xì)胞-AVIC共培養(yǎng)對(duì)Matrilin-2刺激具有更大的炎癥反應(yīng)。

可溶性ECM蛋白促進(jìn)單核細(xì)胞對(duì)AVICs的粘附

接下來(lái)檢查了Matrilin-2刺激后單核細(xì)胞對(duì)AVICs的粘附（圖2 A）。在暴露于Matrilin-2的共培養(yǎng)物中，單核細(xì)胞改變了它們的形態(tài)（大小和形狀），并對(duì)AVICs表現(xiàn)出更大的粘附性。然而，Matrilin-2對(duì)單獨(dú)培養(yǎng)的單核細(xì)胞沒(méi)有顯著影響。圖2 B中的免疫熒光圖像證實(shí)，共培養(yǎng)中的Matrilin-2刺激改變了單核細(xì)胞的形態(tài)并增加了它們對(duì)AVICs的粘附。這些觀察結(jié)果表明，單核細(xì)胞在用Matrilin-2刺激時(shí)粘附于AVICs上。

圖2   單核細(xì)胞在暴露于Matrilin-2的共培養(yǎng)物中粘附于AVICs。

單核細(xì)胞通過(guò)β2-整合素-ICAM-1相互作用增強(qiáng)AVICs對(duì)可溶性ECM蛋白的炎癥反應(yīng)

為了評(píng)估ICAM-1和β2-整合素在介導(dǎo)單核細(xì)胞對(duì)AVICs的粘附和增強(qiáng)AVICs炎癥反應(yīng)中的作用，實(shí)驗(yàn)檢查了用中和抗體阻斷ICAM-1和β2-整合素是否可以在暴露于Matrilin-2的共培養(yǎng)中減弱單核細(xì)胞粘附并抑制AVIC炎癥反應(yīng)。結(jié)果表明，中和ICAM-1和/或β2-整合素顯著減少了粘附在AVICs上的單核細(xì)胞數(shù)量。此外，中和ICAM-1或β2-整合素顯著降低了共培養(yǎng)的AVIC中ICAM-1和IL-6的產(chǎn)生，但對(duì)暴露于Matrilin-2的單獨(dú)培養(yǎng)的AVICs沒(méi)有顯著影響。此外，中和β2-整合素和ICAM-1基本上消除了共培養(yǎng)中由Matrilin-2誘導(dǎo)的ICAM-1和IL-6的產(chǎn)生。因此，Matrilin-2誘導(dǎo)單核細(xì)胞β2-整合素與AVIC中ICAM-1相互作用，并且這種相互作用導(dǎo)致細(xì)胞粘附，增強(qiáng)AVIC對(duì)可溶性ECM蛋白的炎癥反應(yīng)。

YAP和NF-κB參與增強(qiáng)AVIC炎癥反應(yīng)

為了研究AVIC對(duì)可溶性Matrilin-2的炎癥反應(yīng)增強(qiáng)的信號(hào)機(jī)制，實(shí)驗(yàn)確定了Matrilin-2對(duì)Yes相關(guān)蛋白（YAP）和NF-κB的影響，因?yàn)樗鼈冊(cè)诮閷?dǎo)或調(diào)節(jié)細(xì)胞炎癥反應(yīng)中起重要作用。圖3 A顯示Matrilin-2在共培養(yǎng)中上調(diào)YAP和NF-κB磷酸化。為了評(píng)估YAP和NF-kB在調(diào)節(jié)AVIC炎癥反應(yīng)中的作用，在共培養(yǎng)之前用特異性YAP抑制劑（verteporfin）或NF-κB抑制劑（Bay 11-7082）預(yù)處理AVIC 2小時(shí)并暴露于Matrilin-2。抑制AVICs中YAP抑制了共培養(yǎng)中由Matrilin-2誘導(dǎo)的NF-κB磷酸化（圖3 B）。此外，YAP或NF-κB的抑制減弱了共培養(yǎng)中ICAM-1和IL-6的產(chǎn)生（圖3 C、D）。這些結(jié)果表明，YAP參與暴露于單核細(xì)胞和Matrilin-2的AVICs中的NF-κB激活，并且在這種情況下，YAP和NF-κB都在介導(dǎo)AVICs的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮作用。

圖3   Matrilin-2通過(guò)激活YAP-NF-κB信號(hào)增強(qiáng)共培養(yǎng)中的炎癥反應(yīng)。

單核細(xì)胞β2-整合素通過(guò)ICAM-1增強(qiáng)Matrilin-2誘導(dǎo)的AVICs促炎信號(hào)和炎癥反應(yīng)

由于單核細(xì)胞對(duì) AVICs 的粘附取決于β2-整合素與ICAM-1，這種分子相互作用似乎是負(fù)責(zé)增強(qiáng)AVICs炎癥反應(yīng)的原因，實(shí)驗(yàn)最后測(cè)試了重組β2-整合素可以增強(qiáng)AVICs對(duì)Matrilin-2的炎癥反應(yīng)，使用重組的人類CD18蛋白代替表達(dá)在單核細(xì)胞上的β2-整合素，與Matrilin-2聯(lián)合刺激AVICs。雖然單獨(dú)使用CD18不會(huì)增加人AVICs中ICAM-1和IL-6的產(chǎn)生，或YAP和NF-κB磷酸化，但CD18顯著增強(qiáng)了Matrilin-2誘導(dǎo)的AVICs的ICAM-1和IL-6的AVICs產(chǎn)生，以及YAP和NF-κB的磷酸化。ICAM-1的中和減弱了CD18的增強(qiáng)。ICAM-1中和對(duì)炎癥介質(zhì)產(chǎn)生的這種影響與其抑制暴露于Matrilin-2加CD18的AVIC中YAP和NF-κB的增強(qiáng)磷酸化相關(guān)。因此，單核細(xì)胞上的β2-整合素通過(guò)ICAM-1依賴性機(jī)制加劇AVIC炎癥活性，而阻斷 ICAM-1可以抑制這種惡化。

圖4   示意圖總結(jié)了單核細(xì)胞增強(qiáng)人AVIC對(duì)ECM的炎癥反應(yīng)的潛在機(jī)制。單核細(xì)胞β2-整合素與AVIC ICAM-1相互作用，通過(guò)YAP和NF-κB通路增強(qiáng)AVIC 對(duì)可溶性ECM蛋白（可溶性matrilin-2）的炎癥反應(yīng)。

該研究結(jié)果表明，可溶性ECM蛋白誘導(dǎo)單核細(xì)胞與AVICs的相互作用，增強(qiáng)AVIC炎癥活性。單核細(xì)胞β2-整合素和AVIC ICAM-1的相互作用導(dǎo)致AVICs中YAP和NF-κB的激活，這是對(duì)內(nèi)源性促炎因子的炎癥反應(yīng)增強(qiáng)的原因（圖4）。這些新發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了浸潤(rùn)單核細(xì)胞通過(guò)與AVIC的細(xì)胞間相互作用在增加主動(dòng)脈瓣炎癥中的作用，并指出了抑制瓣膜炎癥引起的CAVD進(jìn)展的潛在靶點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)：Luo Z, The E, Zhang P, Zhai Y, Yao Q, Ao L, Zeng Q, Fullerton DA, Meng X. Monocytes augment inflammatory responses in human aortic valve interstitial cells via β2-integrin/ICAM-1-mediated signaling. Inflamm Res. 2022 Jun;71(5-6):681-694. doi: 10.1007/s00011-022-01566Matrilin-2. Epub 2022 Apr 11. PMID: 35411432.

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