維生素B₁₂是一類含有咕啉(corrin)環(huán)的類咕啉(corrinoids)化合物，其通俗名稱又叫做鈷胺素(cobalamin)，是一類含金屬元素的維生素。維生素B₁₂的化學結構如下圖所示，根據(jù)咕啉環(huán)軸向上方的R基不同，形成了不同類型的維生素B₁₂類物質。如羥基（-OH）與咕啉環(huán)中的鈷離子相連形成羥基鈷胺素（hydroxycobalamin），同樣，脫氧腺苷（5'-deoxyadenosyl）、甲基（-CH3）、氰基（-CN）與鈷離子相連分別生成腺苷鈷胺素（deoxyadenosylcobalamin）、甲基鈷胺素（methylcobalamin）和氰鈷胺素（cyanocobalamin）。日常生活中所稱的維生素B₁₂更多是指氰鈷胺素，因其易結晶，不易被空氣氧化，所以常被用作維生素B₁₂的食品添加劑形式。

人體不能合成維生素B₁₂，主要依靠動物性食品提供，含量豐富者有肝腎組織、肉類、蛋類和乳類制品等。此外特殊保健食品、功能性飲料等食品中也會含有相對較多的維生素B₁₂。維生素B₁₂在人體代謝當中起到非常重要的作用，缺乏維生素B₁₂不僅會導致貧血，還會引起心臟病、神經(jīng)紊亂、生育與出生缺陷以及癌癥等。因此一種或幾種能夠精確檢測食品中維生素B₁₂含量的方法十分重要。目前常用的主要有比色測定法、微生物營養(yǎng)缺陷型測定法、酶聯(lián)免疫吸附測定法、高效液相色譜法以及高效液相色譜串聯(lián)質譜法等方法。需要考慮的因素有：動物性食品中維生素B₁₂同時有多種存在形式，如何準確測定其真實含量。其次需要將結合態(tài)維生素B₁₂從鈷胺素結合蛋白中游離出來。還有維生素B₁₂在食品中含量較低，如何有效富集等問題。近期新發(fā)布的國標《GB 5009.285-2022食品安全國家標準 食品中維生素B12的測定》給我們提供了合適的解決方案。

我國現(xiàn)行的國標為《GB 5413.14-2010 食品安全國家標準 嬰幼兒食品和乳品中維生素B12的測定》采用的是微生物法，僅適用于嬰幼兒食品、乳及乳制品中維生素B₁₂的檢測。國際現(xiàn)行方法也是微生物法，美國 AOAC 986.23方法即采用微生物法測定乳基嬰幼兒配方粉中的維生素B₁₂。此外AOAC 2011.10方法采用雙柱切換-液相色譜-紫外檢測法測定嬰兒配方奶粉和成人營養(yǎng)品中的維生素B₁₂。值得一提的是，在2010版國標修訂征求意見稿中也曾將固相萃取-在線柱切換高效液相色譜法納入本標準，但未能出現(xiàn)在最新標準中。

新國標2022版第一法為液相色譜法，適用于嬰幼兒食品、乳及乳制品、肉及肉制品中維生素B₁₂的測定。因其檢測設備和耗材較為廉價、準確度較高而值得推廣。第二法為液相色譜-質譜法，適用于嬰幼兒食品、乳及乳制品、肉及肉制品、即食谷物、烘焙食品、果凍、飲料中維生素B₁₂測定。該方法是將分離性能優(yōu)異的液相色譜法與靈敏度更高、能提供相對分子質量和結構信息的質譜法相結合的現(xiàn)代分離分析技術，同時結合使用我司獨立研發(fā)維生素B₁₂同位素內標，能對維生素B₁₂更加快速、準確的定量，而且能解決飲料等低含量樣品的定量檢測難題。第三法仍為微生物法，適用于嬰幼兒食品、乳及乳制品中維生素B12的測定。

通過以上對比發(fā)現(xiàn)，新國標2022版中增加了多種復雜的樣品基質，提高了方法的適用性，通過使用高特異性的免疫親和柱以及維生素B₁₂同位素內標解決了當前維生素B₁₂分析檢測的難題。在對應的第一法前處理中，試樣經(jīng)酶解后，用溶液將鈷胺素異構體（羥鈷胺素、甲鈷胺素和5-脫氧腺苷鈷胺素等轉化為氰鈷胺素，樣液通過免疫親和柱凈化、濃縮后，反相液相色譜柱分離，紫外檢測器檢測。

維生素B₁₂及其內標的液相色譜-質譜圖

在對應第二法前處理中，稱取試樣后要先加入適量的同位素內標，再按第一法相同操作處理，最后由質譜檢測器分析，因同位素內標的使用，可以有效地校正基質效應和前處理損失，使結果更加精確。