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中藥材中黃曲霉毒素檢測解決方案

來源：無錫冠一生物科技有限公司 2023年02月06日 14:44

致分析工作者

隨著國家對生物毒素類污染殘留的監(jiān)管力度加大，各級實驗室都面臨著盡快建立切實可行的檢測方法，在此就2020版藥典《中國藥典》編寫了《中藥材中黃曲霉毒素分析方法解決方案》，供中藥材檢測實驗室人員參考查詢。

目錄

一、 2020版藥典2351黃曲霉毒素測定法

二、 2020版藥典相比2015版藥典檢測黃曲霉方法變化解讀

三、 SN/T 4604-2016進出口中藥材中真菌毒素的測定（節(jié)選）

四、復雜中藥材樣品測定解決方案

五、 Auto IPS-6060 全自動免疫親和操作儀應(yīng)用于藥典中黃曲霉毒素測定

六、中藥材黃曲霉毒素測定采購指南

七、中藥材黃曲霉毒素測定常見問題舉例

一、2020版藥典2351黃曲霉毒素測定法

第一法 液相色譜法

本法系用高效液相色譜法（通則0512）測定藥材、飲片及制劑中的黃曲霉毒素（以黃曲霉毒素B₁、黃曲霉毒素B₂、黃曲霉毒素G₁、黃曲霉毒素G₂總量計），除另有規(guī)定外，按下列方法測定。

（一）色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

1. 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑

2. 流動相：甲醇-乙腈-水（40:18:42）

3. 采用柱后衍生器檢測

4. ①碘衍生法：衍生溶液為0.05%的溶液(取0.5g，加入甲醇100mL溶解，用水稀釋至1000mL制成），衍生化泵流速0.3mL/min，衍生化溫度70℃；②光化學柱后衍生器（254nm.PriboFast-KRC光化學柱后衍生器.）

5. 熒光檢測器檢測，激發(fā)波長：360nm(365nm) 發(fā)射波長：450nm

6. 兩個相鄰色譜峰的分離度應(yīng)大于1.5。

（二）混合對照品溶液的制備

精密量取黃曲霉毒素混合對照品溶液（黃曲霉毒素B₁、黃曲霉毒素B₂、黃曲霉毒素G₁、黃曲霉毒素G₂標示濃度分別為1.0µg/mL、0.3µg/ mL、1.0µg/ mL、0.3µg/ mL）0.5 mL,置10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，作為儲備溶液。精密量取儲備溶液1 mL，置25 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，即得。

（三）供試品溶液的制備

1. 取供試品粉末約15g(過二號篩)，精密稱定，加入氯化鈉3g，置于均質(zhì)瓶中，精密加入70%甲醇溶液75mL，高速攪拌2min（攪拌速度大于11,000 r/min, 轉(zhuǎn)速22,000 r/min）。

2. 4000r/min離心5分鐘。

3. 精密量取上清液15mL，置50mL量瓶中，用水（專用淋洗緩沖液）稀釋至刻度，搖勻，離心10分鐘（離心速度4000r/min）

4. 準確移取20.0mL樣品提取液，過免疫親和柱，過柱時流速不能快，流速快的話回收效率差，建議采取重力過柱。

5. 用水20mL洗脫（必要時可先用淋洗緩沖液10mL淋洗，再用10mL水淋洗），洗滌液棄去。

6. 為保證洗脫充分，建議以2.0mL色譜甲醇分三步進行洗脫，重力洗脫即可。首先，加入1.0mL甲醇洗脫，當溶劑通過柱子后，孵育30s（孵育即甲醇在柱子中浸泡）；然后，再加入0.5mL甲醇進行洗脫，過柱前孵育30s；最后，再加入0.5mL甲醇洗脫，過柱前孵育30s，并使2-3mL空氣通過柱體，收集洗脫液，置2mL量瓶中，并用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。(免疫親和柱操作建議使用泵流操作架,便于控制各個步驟流速,保證較好的回收率)

7. 測定法：分別精密吸取上述混合對照品溶液5μL、10μL、15μL、20μL、25μL，注入液相色譜儀，測定峰面積，以峰面積為縱坐標，進樣量為橫坐標，繪制標準曲線。另精密吸取上述供試品溶液20～25μL，注入液相色譜儀，測定峰面積，從標準曲線上讀出供試品中相當于黃曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂的量，計算，即得。

第二法 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

本法系用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定藥材、飲片及制劑中的黃曲霉毒素（以黃曲霉毒素B₁、黃曲霉毒素B₂、黃曲霉毒素G₁、黃曲霉毒素G₂總量計），除另有規(guī)定外，按下列方法測定。

（一）色譜、質(zhì)譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

以十八烷基硅烷鍵硅膠填充劑；以10mmol/L醋酸銨溶液為流動相A，以甲醇為流動相B；柱溫25℃；流速0.3mL/min；按下表中的規(guī)定進行梯度洗脫。

以三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜檢測；噴霧離子源ESI)，采集模式為離子模式；各化合物監(jiān)測離子對和撞壓(CE)見下表。

（二）系列混合對照品溶液的制備

精密量取黃曲霉毒素混對照品溶液（黃曲霉毒素B₁、黃曲霉毒素B₂、黃曲霉毒素G₁、黃曲霉毒素G₂標示濃度分別為1.0µg/mL、0.3µg/mL、1.0µg/mL、0.3µg/mL）適量，用70%甲醇稀釋成含黃曲霉毒素B₂、G₂濃度為0.04?3ng/mL，黃曲霉毒素B₁、G₁濃度為0.12?l0ng/mL的系列對照品溶液，即得（必要時根據(jù)樣品實際情況，制系列基質(zhì)對照品溶液）

（三）供試品溶液的制備同第一法

測定法精密吸取上述系列對照品溶液各5μL,注入高效液相色譜-質(zhì)譜，測定峰面積，以峰面積縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準。另精密吸取上述供試品溶液5μL，注入高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜，從標準曲線上讀出供試品中相當于黃曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂的量，計算，即得。

第三法 酶聯(lián)免疫法

本法系用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定藥材、飲片及制劑中的黃曲霉毒素（以黃曲霉毒素B₁，或黃曲霉毒素B₁、黃曲霉毒素B₂、黃曲霉毒素G₁、黃曲霉毒素G₂總量計），除另有規(guī)定外，按下列方法測定。

（一）標準品溶液的制備

精密量取 PriboFast^®STD#1041黃曲霉毒素B₁標準品溶液，PriboFast^®STD#1082AFT黃曲霉毒素混合標準品溶液用硫酸鹽緩沖液稀釋成每1L含0 µg、0.05 µg、0.15 µg、0.45 µg、1.35 µg（測定黃曲霉毒素B₁）或0 µg、0.025 µg、0.075 µg、0.225 µg、0.675 µg（測定黃曲霉毒素總量）的系列標準品溶液，即得。

（二）供試品溶液的制備

1. 供試品粉末2.0g至50mL離心管中，20mL甲醇振蕩5min，離心5min（3000r/min）。

2. 取2mL上清液至10mL干凈離心管中，50-60℃水浴氮氣流下吹干。

3. 加入2mL去離子水振動30秒，加入6mL 振蕩2min，離心5min（3000r/min）。

4. 取下層液3-10mL于離心管中，置氮吹儀于50-60℃水浴濃縮至干，加入1mL正己烷渦旋30秒，再加入2mL磷酸鹽緩沖液渦旋1min，離心5min（3000r/min），取下層液，即得。

（三）測定法

黃曲霉毒素B₁和黃曲霉毒素總量的測定：分別采用合適濃度的抗體包被微孔板孔，經(jīng)封閉、干燥等處理后加入系列標準品溶液，再加入經(jīng)酶標抗原稀釋液稀釋至合適工作濃度的酶標抗原，混勻，于25℃反應(yīng)45min，用洗滌工作液洗滌，每孔加入底物顯色液100μL，于25℃反應(yīng)15min，每孔加入終止液50μL，采用酶標儀于450nm處，參比波長630nm，測定每孔吸光度值。

注：

（1）測定前，可選擇陰性樣本進行添加回收試驗，樣本回收率應(yīng)在60%-120%。

（2）線性回歸的相關(guān)系數(shù)應(yīng)不低于0.990。

（3）供試品溶液百分吸光率超出標準曲線范圍時，須對已制備好的供試品溶液進行稀釋，使其百分吸光率落入曲線范圍后再檢測。

（4）當測定結(jié)果超出限度時，采用第二法進行確認。

【附注】

1. 本實驗應(yīng)有相應(yīng)的安全、防護措施，并不得污染環(huán)境。

2. 殘留有黃曲霉毒素的廢液或廢渣的玻璃器皿，應(yīng)置于專用貯存容器（裝有10%次氯酸鈉溶液）內(nèi)，浸泡24小時以上，再用清水將玻璃器皿沖洗干凈。

二、2020版藥典相比2015版藥典檢測黃曲霉方法變化解讀

三、SN/T 4604-2016 進出口中藥材中真菌毒素的測定（節(jié)選）

1. 范圍

本標準規(guī)定了進出口中藥材中黃曲霉毒素B_1、B_2、G_1、G_2、M_1、M₂，赭曲霉素A，伏馬毒素B_1、B₂，T-2毒素，HT-2毒素，二羥基苯甲酸內(nèi)脂類真菌毒素的液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜檢測方法。

本標準適用于進出口當歸、桔梗五味子、枸杞、大青葉、金銀花、地龍中黃曲霉B_1、B_2、G_1、G_2、M_1、M₂，赭曲霉素A，伏馬毒素B_1、B₂，T-2毒素，HT-2毒素，二羥基苯甲酸內(nèi)脂類真菌毒素的液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜檢測方法。

2. 分析步驟

(1) 提取

稱取5g試樣(精確到0.01g)置于50 mL具塞塑料離心管中，加人1g氧化鈉，再加人PBS溶液25 mL，均質(zhì)提取2 min，5000 r/min離心10 min，將全部上清液用玻璃纖維濾紙過濾后得提取液A；向殘渣中加人25 mL甲醇，均質(zhì)提取2 min，5000 r/min離心10 min，取上清液10 mL，用PBS稀釋至100 mL，用玻璃纖維濾紙過濾后得到提取液B。

(2) 免疫親和柱凈化

稱取5g試樣(精確到0.01g)置于50 mL具塞塑料離心管中，加人1g氧化鈉，再加人PBS溶液25 mL，均質(zhì)提取2 min，5 000 r/min離心10 min，將全部上清液用玻璃纖維濾紙過濾后得提取液A；向殘渣中加人25 mL甲醇，均質(zhì)提取2 min，5000 r/min離心10 min，取上清液10 mL，用PBS稀釋至100 mL，用玻璃纖維濾紙過濾后得到提取液B。

將免疫親和柱連接于10 mL玻璃針筒下,將50 mL提取液B全部通過免疫親和柱(PriboFast^®復合免疫親和柱)(流速控制在1滴/s~2滴/s)然后用10 mL含0.1%吐溫的PBS淋洗親和柱，再將5mL提取液A通過免疫親和柱（流速控制在1~2滴/S）。待提取液全部通過親和柱，用5mL含0.1%吐溫的PBS和20mL水淋洗親和柱，直至空氣進入親和柱，棄去全部流出液；用2 mL甲醇淋洗親和柱(流速控制在1滴/S)，當甲醇大部分過柱時，停止加壓，靜置孵育5 min，再用2 mL甲醇淋洗親和柱(流速控制在1滴/S)，收集全部淋洗液；將淋洗液置于40℃下水浴氮氣吹干，用1 mL甲醇-2 mmol/L乙酸銨溶液(含0.1%甲酸)(40：60體積比)溶解殘渣，過0.22 μm有機系濾膜，用液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜測定。

四、復雜中藥材樣品測定解決方案

針對目前藥典方法檢測中藥材中黃曲霉毒素過程中出現(xiàn)的決明子、遠志、檳郎等個別樣品基質(zhì)復雜，凈化效果差，譜圖中雜質(zhì)峰過多的問題，普瑞邦技術(shù)中心制定了一套針對中藥材前處理的解決方案。應(yīng)用此解決方案進行樣品前處理，經(jīng)高效液相色譜柱后光化學衍生進行檢測可達到較好的凈化效果，雜峰明顯減少，使分析結(jié)果更加準確。供廣大同行老師參考：

圖1 方法優(yōu)化后（左）與優(yōu)化前（右）遠志樣品過柱對比

圖2 方法優(yōu)化后遠志樣品加標與標準品疊加對比

圖3 方法優(yōu)化前遠志樣品加標與標準品疊加對比

五、Auto IPS-6060 全自動免疫親和操作儀應(yīng)用于藥典中黃曲霉毒素測定

通過Auto IPS-6060 全自動免疫親和操作儀在2015版藥典中檢測黃曲霉的案例，對比手工的精密度和回收率。全自動免疫親和操作儀不但在具體的方法操作和技術(shù)運用上更加先進，而且在整個分析過程中都有非常嚴格的質(zhì)量控制和質(zhì)量保證，確保分析結(jié)果準確，排除人為操作造成的實驗誤差。

黃曲霉毒素B、G混標

表1：精密度與回收率比對表

序號	手動			IPS
序號	結(jié)果μg/kg	回收率%	精密度%	結(jié)果μg/kg	回收率%	精密度%
1（遠志樣品）	ND	——	——	ND	——	——
2（遠志加標）	7.03	70.3	11.1	7.74	77.4	5.7
3（遠志加標）	8.71	87.1		8.66	86.6
4（遠志加標）	7.53	75.3		8.05	80.5

*注：上表采用遠志樣品，按照10μg/kg進行添加。

表2：成本及操作比對表

對比	時間成本	操作
手動	2h	復雜
IPS	1h	簡單
IPS優(yōu)勢	節(jié)省1h	簡單、一致性好

*注：上表按照4支柱子進行對比。

Auto IPS-6060 全自動免疫親和操作儀在進行過免疫親和柱實驗中得到了優(yōu)于手動過柱的結(jié)果，通過比對不難發(fā)現(xiàn)，Auto IPS-6060 全自動免疫親和操作儀在回收率和精密度方面有所提高，大大節(jié)省了人力以及時間成本，同時也縮短了實驗人員接觸試劑的時間，保證了實驗人員的安全。

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中藥材中黃曲霉毒素檢測解決方案

一、2020版藥典2351黃曲霉毒素測定法

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