以下是傳統(tǒng)檢測過程中遇到的一些挑戰(zhàn)：

過去，內(nèi)毒素檢測并不像今天這樣。多年來，它已經(jīng)從家兔熱原試驗演變?yōu)榻裉斐Ｓ玫膭恿W(xué)方法。現(xiàn)代實驗室中常用的動力學(xué)方法之一是動態(tài)顯色分析法。在進行動態(tài)顯色分析前，必須先完成幾個步驟和檢測，以確保產(chǎn)品可以用這種方法進行分析。這些步驟通常在開發(fā)和發(fā)布一種新產(chǎn)品、過渡到新的鱟試劑供應(yīng)商或更改為新的藥典方法時使用。

必須先完成幾次計算，才能確定如何分析產(chǎn)品并認為產(chǎn)品可以安全使用。計算內(nèi)毒素限值、最大有效稀釋度（MVD）和/或最小有效濃度（MVC）以確保產(chǎn)品不會對患者造成不良影響，并且可以按照法規(guī)要求進行適當?shù)姆治?。美國藥典USP<85>，USP<1085>，AAMI標準和其他法規(guī)準則提供了確定這些值的公式和進一步指南。這些計算可以手動完成，也可以借助某些具有這些計算能力的內(nèi)毒素軟件進行。

研究發(fā)現(xiàn)大多數(shù)藥品都會在一定程度上干擾（抑制或增強）細菌內(nèi)毒素檢測，但由于鱟試劑檢測具有很高的靈敏度，通?？梢酝ㄟ^在水中稀釋內(nèi)毒素來克服這些干擾。在計算出內(nèi)毒素限值和MVD之后，必須完成一項研究以確定克服干擾（DROI）所需的稀釋度。這項研究通常稱為方法適用性或產(chǎn)品表征，它以高達MVD并可能包括MVD的多種稀釋度分析產(chǎn)品。

在此過程中，將密切監(jiān)控陽性產(chǎn)品對照（PPC）的回收率，以尋找可能發(fā)生的任何潛在抑制或增強作用。PPC回收率用于確定待分析產(chǎn)品的最佳稀釋度。應(yīng)當使用每種稀釋液的幾份重復(fù)樣來完成這項研究，以證明其可重復(fù)性，并考慮到微孔板制備過程中可能發(fā)生的任何誤差。如果已經(jīng)證明很難通過僅用水稀釋BET來克服產(chǎn)品中的重大干擾，則可以采取以下措施：使用可替代的鱟試劑、熱失活（在蛋白質(zhì)存在下），使用特異的Tris或內(nèi)毒素特定緩沖液，或用1 mM螯合劑（EDTA）稀釋。

一旦確定了DROI和潛在的樣品預(yù)處理，就必須使用相同的鱟試劑供應(yīng)商和方法對至少三個批次的產(chǎn)品進行檢測，以確認其有效性。QC實驗室通常會在軟件外部跟蹤對三個批次的分析，但某些內(nèi)毒素軟件可以跟蹤產(chǎn)品驗證，查看每批經(jīng)過驗證的產(chǎn)品并簽署產(chǎn)品驗證。這些軟件功能可以使結(jié)果井井有條且易于訪問，從而加快驗證過程。

除了產(chǎn)品特性研究外，在建立并驗證平臺后，必須對所使用的鱟試劑進行確效。這至少要使用三種內(nèi)毒素濃度，這些濃度要超過鱟試劑生產(chǎn)商所述的范圍，每種濃度的至少使用三份重復(fù)樣進行檢測。必須對每批新的鱟試劑完成該檢測，以確保其適合使用。

無論是完成方法適用性測試、鱟試劑批次確認，還是常規(guī)檢測，最耗時的步驟是微孔板本身的設(shè)置。要確保96孔微孔板或凝膠檢測設(shè)置沒有任何污染或移液錯誤，對精確度和專注度的要求非常高。對于傳統(tǒng)的96孔微孔板，即使是最熟練的分析員，整個板的設(shè)置時間也可能需要一個小時以上。即使方法適用性基于生化基礎(chǔ)，這種冗長的設(shè)置過程也會導(dǎo)致效率低下。檢測一個樣品需要用另一個鱟試劑供應(yīng)商的配方來重復(fù)其適用性，這很容易將過程延長到幾天或幾周才能完成，而QC實驗室可能沒有這個能力。目前很少有創(chuàng)新的解決方案可以幫助QC實驗室簡化這一過程，但近期開發(fā)的先進的自動化功能可以大大節(jié)省時間和簡化程序。

一旦完成產(chǎn)品驗證或鱟試劑確認，就可以建立常規(guī)檢測方案，以簡化每日和每周的檢測需求。一些軟件可以協(xié)助這一過程，使分析員能夠創(chuàng)建檢測模板，在登錄后可快速訪問，立即開始檢測，從而減少設(shè)置時間并增加樣品檢測量。

細菌內(nèi)毒素檢測看上去令人望而卻步，需要遵循許多步驟，完成許多批次的檢測以確認檢測方法可行，而以上也僅是內(nèi)毒素檢測所要面對的挑戰(zhàn)中的一個部分！還需要對分析員進行全面的培訓(xùn)，實驗室必須進行正確設(shè)置和維護，且所有過程都必須把合規(guī)性放在重位。使用自動化和軟件來減少內(nèi)毒素檢測的壓力和負擔(dān)，以減輕QC實驗室內(nèi)分析員和管理人員的日常工作壓力。

本文作者：Sydney Jannetta（Sievers分析儀生命科學(xué)產(chǎn)品應(yīng)用專家），原文英文版刊登于《American Pharmaceutical Review》2021年1-2月刊，本文有所修改。