以下是傳統(tǒng)檢測(cè)過(guò)程中遇到的一些挑戰(zhàn)：

過(guò)去，內(nèi)毒素檢測(cè)并不像今天這樣。多年來(lái)，它已經(jīng)從家兔熱原試驗(yàn)演變?yōu)榻裉斐Ｓ玫膭?dòng)力學(xué)方法。現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)室中常用的動(dòng)力學(xué)方法之一是動(dòng)態(tài)顯色分析法。在進(jìn)行動(dòng)態(tài)顯色分析前，必須先完成幾個(gè)步驟和檢測(cè)，以確保產(chǎn)品可以用這種方法進(jìn)行分析。這些步驟通常在開(kāi)發(fā)和發(fā)布一種新產(chǎn)品、過(guò)渡到新的鱟試劑供應(yīng)商或更改為新的藥典方法時(shí)使用。

必須先完成幾次計(jì)算，才能確定如何分析產(chǎn)品并認(rèn)為產(chǎn)品可以安全使用。計(jì)算內(nèi)毒素限值、最大有效稀釋度（MVD）和/或最小有效濃度（MVC）以確保產(chǎn)品不會(huì)對(duì)患者造成不良影響，并且可以按照法規(guī)要求進(jìn)行適當(dāng)?shù)姆治觥Ｃ绹?guó)藥典USP<85>，USP<1085>，AAMI標(biāo)準(zhǔn)和其他法規(guī)準(zhǔn)則提供了確定這些值的公式和進(jìn)一步指南。這些計(jì)算可以手動(dòng)完成，也可以借助某些具有這些計(jì)算能力的內(nèi)毒素軟件進(jìn)行。

研究發(fā)現(xiàn)大多數(shù)藥品都會(huì)在一定程度上干擾（抑制或增強(qiáng)）細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)，但由于鱟試劑檢測(cè)具有很高的靈敏度，通?？梢酝ㄟ^(guò)在水中稀釋內(nèi)毒素來(lái)克服這些干擾。在計(jì)算出內(nèi)毒素限值和MVD之后，必須完成一項(xiàng)研究以確定克服干擾（DROI）所需的稀釋度。這項(xiàng)研究通常稱(chēng)為方法適用性或產(chǎn)品表征，它以高達(dá)MVD并可能包括MVD的多種稀釋度分析產(chǎn)品。

在此過(guò)程中，將密切監(jiān)控陽(yáng)性產(chǎn)品對(duì)照（PPC）的回收率，以尋找可能發(fā)生的任何潛在抑制或增強(qiáng)作用。PPC回收率用于確定待分析產(chǎn)品的最佳稀釋度。應(yīng)當(dāng)使用每種稀釋液的幾份重復(fù)樣來(lái)完成這項(xiàng)研究，以證明其可重復(fù)性，并考慮到微孔板制備過(guò)程中可能發(fā)生的任何誤差。如果已經(jīng)證明很難通過(guò)僅用水稀釋BET來(lái)克服產(chǎn)品中的重大干擾，則可以采取以下措施：使用可替代的鱟試劑、熱失活（在蛋白質(zhì)存在下），使用特異的Tris或內(nèi)毒素特定緩沖液，或用1 mM螯合劑（EDTA）稀釋。

一旦確定了DROI和潛在的樣品預(yù)處理，就必須使用相同的鱟試劑供應(yīng)商和方法對(duì)至少三個(gè)批次的產(chǎn)品進(jìn)行檢測(cè)，以確認(rèn)其有效性。QC實(shí)驗(yàn)室通常會(huì)在軟件外部跟蹤對(duì)三個(gè)批次的分析，但某些內(nèi)毒素軟件可以跟蹤產(chǎn)品驗(yàn)證，查看每批經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的產(chǎn)品并簽署產(chǎn)品驗(yàn)證。這些軟件功能可以使結(jié)果井井有條且易于訪問(wèn)，從而加快驗(yàn)證過(guò)程。

除了產(chǎn)品特性研究外，在建立并驗(yàn)證平臺(tái)后，必須對(duì)所使用的鱟試劑進(jìn)行確效。這至少要使用三種內(nèi)毒素濃度，這些濃度要超過(guò)鱟試劑生產(chǎn)商所述的范圍，每種濃度的至少使用三份重復(fù)樣進(jìn)行檢測(cè)。必須對(duì)每批新的鱟試劑完成該檢測(cè)，以確保其適合使用。

無(wú)論是完成方法適用性測(cè)試、鱟試劑批次確認(rèn)，還是常規(guī)檢測(cè)，最耗時(shí)的步驟是微孔板本身的設(shè)置。要確保96孔微孔板或凝膠檢測(cè)設(shè)置沒(méi)有任何污染或移液錯(cuò)誤，對(duì)精確度和專(zhuān)注度的要求非常高。對(duì)于傳統(tǒng)的96孔微孔板，即使是最熟練的分析員，整個(gè)板的設(shè)置時(shí)間也可能需要一個(gè)小時(shí)以上。即使方法適用性基于生化基礎(chǔ)，這種冗長(zhǎng)的設(shè)置過(guò)程也會(huì)導(dǎo)致效率低下。檢測(cè)一個(gè)樣品需要用另一個(gè)鱟試劑供應(yīng)商的配方來(lái)重復(fù)其適用性，這很容易將過(guò)程延長(zhǎng)到幾天或幾周才能完成，而QC實(shí)驗(yàn)室可能沒(méi)有這個(gè)能力。目前很少有創(chuàng)新的解決方案可以幫助QC實(shí)驗(yàn)室簡(jiǎn)化這一過(guò)程，但近期開(kāi)發(fā)的先進(jìn)的自動(dòng)化功能可以大大節(jié)省時(shí)間和簡(jiǎn)化程序。

一旦完成產(chǎn)品驗(yàn)證或鱟試劑確認(rèn)，就可以建立常規(guī)檢測(cè)方案，以簡(jiǎn)化每日和每周的檢測(cè)需求。一些軟件可以協(xié)助這一過(guò)程，使分析員能夠創(chuàng)建檢測(cè)模板，在登錄后可快速訪問(wèn)，立即開(kāi)始檢測(cè)，從而減少設(shè)置時(shí)間并增加樣品檢測(cè)量。

細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)看上去令人望而卻步，需要遵循許多步驟，完成許多批次的檢測(cè)以確認(rèn)檢測(cè)方法可行，而以上也僅是內(nèi)毒素檢測(cè)所要面對(duì)的挑戰(zhàn)中的一個(gè)部分！還需要對(duì)分析員進(jìn)行全面的培訓(xùn)，實(shí)驗(yàn)室必須進(jìn)行正確設(shè)置和維護(hù)，且所有過(guò)程都必須把合規(guī)性放在重位。使用自動(dòng)化和軟件來(lái)減少內(nèi)毒素檢測(cè)的壓力和負(fù)擔(dān)，以減輕QC實(shí)驗(yàn)室內(nèi)分析員和管理人員的日常工作壓力。

本文作者：Sydney Jannetta（Sievers分析儀生命科學(xué)產(chǎn)品應(yīng)用專(zhuān)家），原文英文版刊登于《American Pharmaceutical Review》2021年1-2月刊，本文有所修改。