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清潔驗證:微生物總有機碳回收率和線性

來源:威立雅Sievers分析儀   2023年03月06日 13:57  
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簡介

在生產(chǎn)消費品時,有效地清潔生產(chǎn)設(shè)備對質(zhì)量控制來說至關(guān)重要。清潔工藝的目標是降低產(chǎn)品污染的風險,有效的清潔工藝可以將風險降低到可接受的水平,以確保產(chǎn)品質(zhì)量。如果無法衡量和驗證清潔工藝的有效性,就無法了解產(chǎn)品質(zhì)量和消費者安全的風險。


根據(jù)美國食品和藥品管理局(FDA)提供的數(shù)據(jù),2017年食品和飲料行業(yè)產(chǎn)品召回的主要原因是微生物對產(chǎn)品的污染。對于減少和消除微生物污染來說,強有力的清潔工藝至關(guān)重要,因此監(jiān)控清潔工藝有效性的方法同樣至關(guān)重要。


總有機碳(TOC)分析是消費品生產(chǎn)商廣泛采用的非專屬方法,用于檢測產(chǎn)品、清潔劑、以及微生物等污染物的殘留量。


為了證明TOC分析法適用于預(yù)期用途,我們對設(shè)備清潔之后可能尚存的殘留物進行了回收和線性研究。工廠通常會測試化學污染物和化合物,但很少用TOC分析法來測試微生物的回收率。本文旨在探討對于清潔驗證和確認,TOC分析法能否證明可接受的微生物污染回收率和線性。


實驗設(shè)計和設(shè)置

我們同科羅拉多大學博爾德分校合作,用一整夜時間在胰酶大豆肉湯中培養(yǎng)100毫升枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。以4500轉(zhuǎn)/分鐘的速度將最終培養(yǎng)物的十毫升等分試樣離心分離10分鐘,形成細胞沉淀。


在每次離心之間,倒出上面的液體,用渦旋混合方法用10毫升超純水使沉淀細胞重新懸浮。重復(fù)此過程7次。設(shè)計淋洗循環(huán)以除去細胞培養(yǎng)基帶來的TOC污染。在第7次淋洗循環(huán)后,根據(jù)已有的4,6-二氨基-2-苯基吲哚(4,6-diaminidino-2-phenylindole,DAPI)染色任務(wù)來對細胞進行重新懸浮、稀釋、計數(shù)(見圖1)。

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圖 1:枯草芽孢桿菌在細胞計數(shù)的熒光顯微鏡成像


確定細胞密度之后,用Sievers® M9 TOC分析儀測量1 ppm確認標樣組,然后進行三次細胞濃度稀釋。在測量TOC之后,用0.45 μm滅菌過濾器過濾剩余樣品,除去細菌(見圖2)。然后再次測量TOC以確定每個樣品的非細胞背景TOC(見圖2)。

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圖2:枯草芽孢桿菌的過濾過程


結(jié)果


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表 1:微生物細胞密度與TOC的相關(guān)性結(jié)果


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圖 3:微生物細胞密度與TOC的線性關(guān)系


表1和圖3是微生物TOC相關(guān)性研究的結(jié)果。線性趨勢線的R2值為0.9981,表明實測細胞密度有良好的線性趨勢。根據(jù)圖3所示的線性擬合趨勢線方程,定義為3倍噪聲的檢測水平(LOD,Level of Detection)為2.74E+06細胞/mL。此外,根據(jù)線性擬合趨勢線和M9儀器規(guī)格,50 ppm的最大儀器定量限為2.49E+08細胞/mL。


在進行微生物TOC定量之后,分別將1毫升的每種細胞密度溶液放在不銹鋼試樣板上進行試樣污染,然后使試樣干燥。此試樣污染的目的是確定微生TOC相關(guān)結(jié)果的目視檢測限。圖4是微生物試樣污染圖。

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圖 4:微生物試樣板污染

(A) 5.8E+07

細胞/mL

(B) 5.8E+06

細胞/mL

(C) 5.8E+05

細胞/mL


討論與結(jié)論

微生物TOC相關(guān)結(jié)果和試樣污染圖都說明了連續(xù)監(jiān)測已有的清潔工藝有效性的重要性。在理想光線下,很容易在試樣板上看到最高細胞密度(5.8E+07細胞/mL)的污染斑。而對于較低細胞密度,即使光線很好,也很難在試樣板上看到污染斑。這表明除了強有力的清潔工藝之外,還需要用非目測的方法來測試清潔工藝的有效性。


根據(jù)收集的數(shù)據(jù),可以想象用于生產(chǎn)消費品的設(shè)備上仍有顯著微生物污染,卻僅憑目視檢查就被投放到生產(chǎn)中,導(dǎo)致嚴重后果。因此必須連續(xù)監(jiān)測已有的清潔工藝的有效性,才能降低產(chǎn)品質(zhì)量風險和消費者安全風險。


最后,由于微生物分子組成的不確定性,很難確定微生物溶液的回收率。本研究根據(jù)先前在確定活性微生物細胞中的碳含量時的發(fā)現(xiàn),旨在確定微生物溶液的理論回收率。圖5是理論微生物TOC產(chǎn)出量的計算過程。基于每個細胞的碳原子參考數(shù),5.8E+07細胞/mL的理論TOC濃度為11.6 ppm。

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圖 5:理論微生物 TOC 產(chǎn)出量的維度分析


在本文的實驗中,測量到5.8E+07細胞/mL的TO實際回收值為9.13 ppm,對挑戰(zhàn)性的化合物的回收率為78.7%,從而證明實驗方法是成功的。


總之,本研究用Sievers M9 TOC分析儀演示了在清潔驗證和確認時的細胞密度同目視檢測限的關(guān)系,成功地證實了微生物TOC回收率。實驗數(shù)據(jù)支持使用Sievers TOC分析儀來確認設(shè)備清潔度,同時表明除了目視檢查之外還須考慮使用監(jiān)測微生物污染的定量方法。TOC分析法是測量殘留物、監(jiān)測清潔工藝、降低總體風險的有效方法。Sievers分析儀為您提供能解決您一切清潔驗證和確認需求的TOC解決方案、服務(wù)、支持。


參考文獻


1. Recall Index and Spotlight. Expert Solutions

2. DAPI Protocol For Fluorescence Imaging Thermo-Fisher Scientific – US

3. Phillips, Rob, and Ron Milo. “A Feeling for the Numbers in Biology.” Proceedings of the National Academy of Sciences 106, no. 51 (December 22, 2009): 21465.




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