分光光度計操作規(guī)程與光譜分析技術(shù)

一、儀器設(shè)備

721、723可見分光光度計、752紫外可見分光光度計、UV－2401PC紫外可見分光光度計、UV－3150PC紫外可見近紅外分光光度計、RF-5301PC熒光分光光度計、比色液及標準溶液、濾紙等。

二、儀器結(jié)構(gòu)

三、原　　理
光譜儀器是一種簡單易用的分光光度法測定通用儀器，不同型號的機器測定的波長范圍不同，可以根據(jù)自己的需要選擇要使用的儀器。
不同型號的光譜儀器的構(gòu)造有很大的差別，但是其基本原理是相同的。根據(jù)溶液中各種成分對透過光的吸光度不同，在一定范圍內(nèi)，吸光值（或者透過率）與溶質(zhì)的濃度成正比（玻爾定律）。通過準確濃度的標準品對應(yīng)其吸光值（透過率）作圖，我們就可以得到一條標準曲線。測定未知濃度的待測樣品的吸光值（透過率），與標準曲線相比較就可以得到其濃度。

四、適用范圍
可廣泛用于醫(yī)學(xué)衛(wèi)生、臨床檢測、生物化學(xué)、石油化工、環(huán)保檢測、質(zhì)量控制等方面作定量、定性分析。
具體到我們實驗室，可以對多糖、蛋白、核酸等物質(zhì)進行定性、定量測量。同時UV－3150PC紫外可見近紅外分光光度計還可以測量近紅外區(qū)的固體、液體樣品的吸收光譜，RF-5301PC熒光分光光度計可以測定熒光物質(zhì)的發(fā)光強度光譜，同時他們自帶的軟件可以方便的進行數(shù)據(jù)處理與分析。

五、操作步驟
我們以UV－3150PC紫外可見近紅外分光光度計為例講述光譜儀器的性能和操作方法。
1、插上電源，打開光度計前面的電源開關(guān)。
2、雙擊計算機桌面UVProbe圖標，打開UVProbe軟件，點擊UVProbe中“Connect”圖標聯(lián)機，出現(xiàn)自檢畫面。
3、如自檢*部綠燈亮，則點擊“OK”進入系統(tǒng)。若出現(xiàn)紅燈亮，可關(guān)掉光度計重新連接，若仍未通過自檢，應(yīng)立即報告儀器負責(zé)老師。
4、*通過并進入系統(tǒng)，出現(xiàn)UVProbe菜單欄和工具欄。UVProbe有四大主要模塊，包括光譜掃描模塊、光度測量模塊、時間掃描模塊和報告生成器。每種模式都可以直接點擊后面的方法設(shè)定按鈕設(shè)置方法。
5、點下光譜掃描圖標，出現(xiàn)光譜掃描界面。
6、點擊方法按鈕，出現(xiàn)方法設(shè)置對話框。在此可以設(shè)置掃描波長范圍，儀器的zui大范圍為3200～190nm?？梢栽O(shè)置掃描速度，一般可選中速（Medium）或快速（Fast）進行掃描。采樣間隔表示光度計每隔多少nm讀一個吸光度值，如沒有特殊要求，選擇自動即可。可選擇是否重復(fù)掃描曲線，若重復(fù)則設(shè)置重復(fù)次數(shù)和間隔時間。
7、點擊“Sample Preparation”輸入樣品信息。包括樣品的質(zhì)量、體積、稀釋倍數(shù)和測量光程等。也可以輸入樣品的其他信息。
8、點擊“Instrument Parameters（儀器參數(shù)）”設(shè)置測量方式和儀器的一些參數(shù)。在測量模式中可選擇“Transmittance（透過率）”、“Absorbance（吸光度）”、“Energy（能量）”和“Reflectance（反射）”，其中Reflectance一般用積分球測定固體樣品時使用。狹縫設(shè)置在3200～800nm下設(shè)為5nm，在800～190nm設(shè)為2nm。若包括這兩個范圍的波長如1500～500nm則選擇狹縫為5nm。
9、換燈和檢測器可根據(jù)所測樣品進行設(shè)置，換燈在393～282nm范圍內(nèi)任意值均可，換檢測器在895～750nm范圍內(nèi)任設(shè)一個值即可。但換燈和檢測器由于儀器進行機械的移動，會造成信號波動較大，稱儀器噪音大，此時所得掃描曲線誤差較大，所以所設(shè)波長應(yīng)該避免在樣品吸收峰位置以免影響測定值。
10、所有參數(shù)設(shè)置完成后，兩個樣品架均不放置樣品或兩個均放上同樣的空白溶液，點擊“Baseline”，開始進行基線校正，儀器掃描完成后，點擊“λGoToWL”將波長轉(zhuǎn)到750nm，點擊“Auto Zero”把750nm的波長設(shè)為0。點擊“Start”再次掃描，若得出曲線zui值均小于0.001，則認為基線平坦，若數(shù)值較大，則將750nm吸光度設(shè)為0重新進行基線掃描。
11、基線校正完成后，取出樣品架的空白溶液，放入樣品溶液，點擊“Start”開始掃描曲線。掃描完成后，出現(xiàn)保存路徑框和文件名框，設(shè)置好后出現(xiàn)掃描曲線。
12、曲線掃描完成后，在譜圖上點擊鼠標右鍵，出現(xiàn)快捷菜單。點擊“AutoScale”可是軟件自動調(diào)節(jié)圖像坐標使之適合掃描所得數(shù)據(jù)。點擊“Cross Hair>Display”鼠標顯示為交叉線，用鼠標將交叉線放到曲線上某點即可顯示該點的波長和吸光度值。
13、點擊“Label”可以在譜圖上添加標簽，可在其中輸入文本以標記譜圖。點擊“Legend”出現(xiàn)各數(shù)據(jù)保存圖，若在前面框里勾選該光譜數(shù)據(jù)，則在左面重疊圖上顯示其曲線。
14、若從右鍵快捷菜單中選擇“Customize（自定義）”，可以自定義曲線顯示顏色還可定義坐標軸的數(shù)值。
15、得出曲線后可以對譜圖進行一系列的處理。
（1）點擊“DataPrint（顯示數(shù)據(jù)）”圖標可以將譜圖曲線直接顯示為數(shù)值。
（2）點擊“Manipulate（運算）”圖標，可以進行加減乘除、差譜、扣除空白、倒數(shù)光譜、對數(shù)光譜等處理。
（3）點擊“PeakPoint（顯示峰值）”按鈕顯示“波峰”和“波谷”的數(shù)值。
（4）點擊“PointPick”圖標，輸入要顯示的波長值，立即顯示出所輸入波長處的吸光度值。
（5）點擊“PeakArea”，設(shè)定峰閾值，即顯示大于此閾值的峰區(qū)域。
（6）點擊“Sewingbox（裁縫）”圖標，可以進行譜圖的裁剪和縫合。
16、光譜曲線掃描完成后數(shù)據(jù)實際直接保存在內(nèi)存中，并沒有保存到硬盤上，此時若關(guān)閉窗口，電腦會提示“Some Spectrum data has not been saved!Do you still want to exit and lostunsaved change？（還有光譜數(shù)據(jù)尚未保存，你是要離開而不保存數(shù)據(jù)嗎？）”選擇“No”返回主界面保存所有數(shù)據(jù)。

六、注意事項
1、光度計燈源壽命有限，若長時間不測量，應(yīng)通過UVProbe軟件斷開連接（點擊“Disconnect”），然后關(guān)閉光度計電源。
2、使用分光光度計時要保證樣品室干凈，小心放入樣品，放入比色皿前一定要先用濾紙和擦鏡紙將比色皿外表面擦干凈，不要污染樣品池和光度計外表面。
3、儀器自檢和掃描的過程中，不要打開樣品室蓋。
4、軟件不會自動保存數(shù)據(jù)，所有的數(shù)據(jù)要保存都必須點擊“Save”或者“SaveAs”進行另存。否則數(shù)據(jù)會丟失。
5、認真填寫貴重儀器使用記錄。

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