①　典型的引物18到24個(gè)核苷長(zhǎng)。引物需要足夠長(zhǎng)，保證序列獨(dú)te性，并降低序列存在于非目的序列位點(diǎn)的可能性。但是長(zhǎng)度大于24核苷的引物并不意味著更高的特異性。較長(zhǎng)的序列可能會(huì)與錯(cuò)誤配對(duì)序列雜交，降低了特異性，而且比短序列雜交慢，從而降低了產(chǎn)量。  

②　選擇GC含量為40％到60％或GC含量映像模板GC含量的引物。 

③　設(shè)計(jì)5'端和中間區(qū)為G或C的引物。這會(huì)增加引物的穩(wěn)定性和引物同目的序列雜交的穩(wěn)定性。  

④　避免引物對(duì)3'末端存在互補(bǔ)序列，這會(huì)形成引物二聚體，抑制擴(kuò)增。 

⑤　避免3'末端富含GC。設(shè)計(jì)引物時(shí)保證在最后5個(gè)核苷中含有3個(gè)A或T。 

⑥　避免3'末端的錯(cuò)誤配對(duì)。3'端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸。

⑦　避免存在可能會(huì)產(chǎn)生內(nèi)部二級(jí)結(jié)構(gòu)的序列，這會(huì)破壞引物退火穩(wěn)定性。

目的序列上并不存在的附加序列，如限制位點(diǎn)和啟動(dòng)子序列，可以加入到引物5'端而不影響特異性。當(dāng)計(jì)算引物Tm值時(shí)并不包括這些序列，但是應(yīng)該對(duì)其進(jìn)行互補(bǔ)性和內(nèi)部二級(jí)結(jié)構(gòu)的檢測(cè)。  

有時(shí)候，對(duì)于引物設(shè)計(jì)僅了解有限的序列信息。比如，如果僅知道氨基酸序列，可以設(shè)計(jì)兼并引物。兼并引物是指代表編碼單個(gè)氨基酸所有不同堿基可能性的不同序列的混合物。為了增加特異性，可以參考密碼子使用表，根據(jù)不同生物的堿基使用偏好，減少兼并性。次黃piao呤可以同所有的堿基配對(duì)，降低引物的退火溫度。不要在引物的3'端使用兼并堿基，因?yàn)?'端最后3個(gè)堿基的退火足以在錯(cuò)誤位點(diǎn)起始PCR。使用較高的引物濃度（1μM到3μM），因?yàn)樵S多兼并混合物中的引物不是特異性針對(duì)目的模板。  

設(shè)定Tm有幾種公式。高鹽溶液中的雜交，適用于小于18堿基的引物。根據(jù)GC含量估算Tm。確定引物Tm最可信的方法是近鄰分析法。這種方法從序列一級(jí)結(jié)構(gòu)和相鄰堿基的特性預(yù)測(cè)引物的雜交穩(wěn)定性。大部分計(jì)算機(jī)程序使用近鄰分析法。

根據(jù)所使用的公式及引物序列的不同，Tm會(huì)差異很大。因?yàn)榇蟛糠止教峁┮粋€(gè)估算的Tm值，所有退火溫度只是一個(gè)起始點(diǎn)?？梢酝ㄟ^(guò)分析幾個(gè)逐步提高退火溫度的反應(yīng)以提高特異性。開始低于估算的Tm5℃，以2℃為增量，逐步提高退火溫度。較高的退火溫度會(huì)減少引物二聚體和非特異性產(chǎn)物的形成。為獲得最佳結(jié)果，兩個(gè)引物應(yīng)具有近似的Tm值。引物對(duì)的Tm差異如果超過(guò)5℃，就會(huì)引物在循環(huán)中使用較低的退火溫度而表現(xiàn)出明顯的錯(cuò)誤起始。如果兩個(gè)引物Tm不同，將退火溫度設(shè)定為比最di的Tm低5℃?；蛘邽榱颂岣咛禺愋?，可以在根據(jù)較高Tm設(shè)計(jì)的退火溫度先進(jìn)行5個(gè)循環(huán)，然后在根據(jù)較低Tm設(shè)計(jì)的退火溫度進(jìn)行剩余的循環(huán)。這使得在較為嚴(yán)緊的條件下可以獲得目的模板的部分拷貝。