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小反芻獸疫病毒檢測(cè)試劑盒-PCR法

來(lái)源:上海仁捷生物科技有限公司   2023年05月16日 15:22  

【檢驗(yàn)原理】

本試劑盒針對(duì)小反芻獸疫病毒的高度保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物和探針,在反應(yīng)體系中含小反芻獸疫病毒基因組模板的情況下,PCR反應(yīng)得以進(jìn)行并釋放熒光信號(hào)。利用熒光定量PCR儀對(duì)PCR過(guò)程中相應(yīng)通道信號(hào)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和輸出,實(shí)現(xiàn)檢測(cè)結(jié)果的定性分析。

【主要組成成份】

序號(hào)

組成

25T/盒

50T/盒

1

PPRV  RT-PCR反應(yīng)液

437.5 μL×1管

875 μL×1管

2

PPRV 混合酶液

62.5 μL×1管

125 μL×1管

3

PPRV 陽(yáng)性對(duì)照

40 μL×1管

 40 μL×1管

4

PPRV 陰性對(duì)照

40 μL×1管

 40 μL×1管

5

說(shuō)明書(shū)

1份

1份

注:陰性對(duì)照為偶蹄獸類(lèi)基因組DNA,陽(yáng)性對(duì)照為失去活性的小反芻獸疫病毒cDNA。

【儲(chǔ)存條件及有效期】避光-20℃以下保存,避免反復(fù)凍融,有效期12個(gè)月。

【適用儀器】ABI 系列、Bio-Rad系列、Agilent Stratagene MX系列 、Roche LightCycler R480、Cepheid SmartCycler、Rotor-Gene系列、杭州博日系列等多通道實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。

【樣本要求】

1. 適用標(biāo)本類(lèi)型:發(fā)病動(dòng)物血液、空腸及小腸腸內(nèi)容物及組織臟器(腸道組織、腸系膜及淋巴結(jié)等)和病毒培養(yǎng)液。

2. 標(biāo)本采集,方法如下:

(1) 血清:用一次性注射器取靜脈血2-3ml,轉(zhuǎn)至5ml 的干燥管中,密閉送檢。

(2) 腸內(nèi)容物:無(wú)菌條件下取腸道內(nèi)容物約1g 左右,置入1ml 含有1.0ml PBS(或生理鹽水)5ml 離心管中,立即送檢。

(3) 組織臟器:取發(fā)病動(dòng)物腸道組織及腸系膜淋巴結(jié)等組織約1g,置一1.5ml的潔凈離心管中,密閉送檢。

3.應(yīng)避免標(biāo)本間交叉污染。

4.標(biāo)本收集后可立即檢測(cè);若不能立即檢測(cè),可置于28℃冷藏過(guò)夜保存;如需長(zhǎng)期保存,標(biāo)本應(yīng)凍存于-80以下,避免反復(fù)凍融。

【檢驗(yàn)方法】

1. 試劑準(zhǔn)備(試劑準(zhǔn)備區(qū))

1)從冰箱中取出試劑盒, 從試劑盒中取出實(shí)驗(yàn)所需試劑,充分融化混勻并瞬時(shí)離心以去除管壁附著液體。

2)核算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需要的反應(yīng)數(shù)(n),并根據(jù)如下表所示反應(yīng)體系計(jì)算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需要的各種試劑量。

n =陰性對(duì)照數(shù)(1T)+陽(yáng)性對(duì)照數(shù)(1T)+誤差預(yù)留量(1T)+樣本數(shù)

單反液配制表

RT-PCR反應(yīng)液

17.5 μL

混合酶液

 2.5 μL

 

3)在無(wú)菌離心管中加入上述試劑,充分混勻后瞬時(shí)離心。按照20 μL/管分裝量將試劑分裝至PCR反應(yīng)管。

2.樣本準(zhǔn)備(樣本處理區(qū))

QIAGEN、Roche公司RNA提取試劑盒提取RNA,具體操作按照其試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

3.加樣

在上述制備好的PCR反應(yīng)樣本管中分別加入處理好的待測(cè)標(biāo)本RNA各5 μl、終體積25 μl/管,蓋好PCR反應(yīng)蓋混勻后瞬時(shí)低速離心,轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照管則各加5 μL試劑盒自帶的陰性對(duì)照或陽(yáng)性對(duì)照品,終體積為25 μl/管,蓋好PCR反應(yīng)蓋混勻后瞬時(shí)低速離心,轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。

4. PCR(PCR擴(kuò)增區(qū))

1)取樣本處理區(qū)準(zhǔn)備好的PCR反應(yīng)管,放置在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀樣品槽相應(yīng)位置,并記錄放置順序。

2)按下表設(shè)置儀器核酸擴(kuò)增相關(guān)參數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。


反應(yīng)體積

25 μL

通道選擇

FAM通道采集小反芻獸疫病毒熒光信號(hào)

PCR

反應(yīng)

條件

步驟

條件

循環(huán)數(shù)

反轉(zhuǎn)錄

    50℃:10分鐘(min)

1

預(yù)變性

95℃:3分鐘(min)

1

PCR擴(kuò)增

95℃:5秒(s)

40

55℃:40秒(s)

(此階段結(jié)束時(shí)采集熒光信號(hào))

注:ABI系列熒光PCR儀在設(shè)置時(shí)不選ROX校正,設(shè)置淬滅基團(tuán)選擇None。

【參考值(參考范圍)】

1.試劑盒有效性判定:

 1)陽(yáng)性對(duì)照:有典型S型擴(kuò)增曲線或Ct值≤35。

 2)陰性對(duì)照:Ct值>38或無(wú)Ct值,線形為直線或輕微斜線,無(wú)指數(shù)增長(zhǎng)期。

2.標(biāo)本結(jié)果判定:

1)陽(yáng)性:標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果Ct值≤35或有明顯指數(shù)增長(zhǎng)期。

2)可疑:標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果Ct值在3538范圍內(nèi)。此時(shí)應(yīng)對(duì)標(biāo)本進(jìn)行重復(fù)檢測(cè),如重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果Ct值仍在3538范圍內(nèi),有明顯指數(shù)增長(zhǎng)期,則判定為陽(yáng)性,否則為陰性。

3)陰性:標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果Ct值>38或無(wú)Ct值。

【檢驗(yàn)結(jié)果的解釋】

通道及檢測(cè)結(jié)果

標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果解釋

FAM

陽(yáng)性(+)

標(biāo)本中檢出小反芻獸疫病毒RNA

陰性(-)

標(biāo)本中未檢出小反芻獸疫病毒RNA


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