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抗體純化方法及實驗步驟

來源:上海聯(lián)碩生物科技有限公司   2023年05月31日 16:16  

1.鹽析法(飽和硫酸銨沉淀法)

該純化方法是基于在待純化免疫血清中加入飽和硫酸銨溶液,由于抗體也是一種蛋白質(zhì),其在水溶液中的溶解度是由其本身攜帶的親水基團數(shù)和電荷數(shù)決定的,當我們向抗血清中加入飽和硫酸銨溶液后,硫酸根離子和銨根離子與抗體競爭溶液中的水分子,因為硫酸根離子和銨根離子與抗體分子相比,具有更強的親水性,因此抗體分子表面的水化膜被破壞,同時其暴露出來的帶電基團被溶液中的鹽離子所中和進而導(dǎo)致其溶解度大大降低,依據(jù)此原理從而將其從抗血清中分離。


2.正辛酸-飽和硫酸銨沉淀法
該純化方法原理是:正辛酸在偏酸條件下,能與抗血清中或者小鼠腹水中的雜蛋白結(jié)合,在等電點附近將其沉淀,IgG類抗體則存在于上清液中,再利用飽和硫酸銨沉淀法即可進一步提純。


3.Protein A和protein G純化法
基本原理:protein A和proteiin G 可以和抗體IgG分子的Fc段特異性結(jié)合。Protein A和proteinG 作為配基可以被偶聯(lián)到瓊脂糖凝膠上,當抗血清從中流過時,特異性的IgG就與配基結(jié)合,其他雜蛋白則穿流而過。因兩種蛋白純化抗體時對不同宿主的抗體的結(jié)合能力不同,我們需要具體情況具體對待,分別選擇protein A 或者protein G,或者是protein A/protein G組合。一般推薦小鼠單抗IgG2a,IgG2b,IgG3,兔,人,豬的多克隆抗體用protein A純化,而小鼠單抗IgG1, 大鼠單抗,小鼠,大鼠,山羊的多克隆抗體則選擇用protein G純化。


4.免疫親和純化法
基本原理:將抗原作為一種配基偶聯(lián)在sepharose 4B上,血清等生物液體中的特異性抗體與sepharose 4B上的抗原進行特異性結(jié)合,其他雜蛋白和雜抗體則不被結(jié)合,通過洗滌和洗脫等一系列實驗步驟即可得到高純度的目標抗體。本方法雖然和Protein A/G均被稱為親和純化方法,但是純化得到的最終的抗體還是有很大區(qū)別的,ProteinA/G純化得到的主要是非特異性的IgG類抗體,而本方法純化得到的主要是特異性的IgG類抗體,與其他純化方法相比,本方法純化得到的抗體其特異性,純度最高。本純化方法的實驗步驟與protein A/G純化方法基本一致,將實驗方法三的配基protein A/G換成相應(yīng)的目標抗原即可。

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