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HPTLC-MS 應(yīng)用于蛋白質(zhì)的胰蛋白酶水解物的分析研究
近年來，隨著薄層板固定相涂層多樣化的發(fā)展，高效薄層色譜技術(shù)被廣泛應(yīng)用于諸多領(lǐng)域，尤其是 TLC-MS 的聯(lián)用和商業(yè)化設(shè)備的日趨成熟，為生物分析研究提供了新的思路。
研究目的
本研究將肌紅蛋白、細(xì)胞色素 C、β-酪蛋白和牛血清蛋白 (BSA) 等蛋白質(zhì)的胰蛋白酶分解物中的肽通過高效薄層色譜法進(jìn)行分離，然后通過與 ESI-MS 偶聯(lián)在薄層板上原位分析，確定序列覆蓋率并與液相檢測結(jié)果進(jìn)行比較。
研究方法及分析結(jié)果
使用一維 HPTLC 最多分離得到 20 個條帶，獲得非常緊湊的薄層色譜區(qū)，這大約是通過胰蛋白酶消化蛋白質(zhì)樣品獲得的肽的數(shù)量 (例如細(xì)胞色素 C 由 104 個氨基酸組成，經(jīng)過胰蛋白酶消化后形成 17 個肽）。
HPTLC 一維分離色譜圖：
圖 1. 熒光胺顯色-366nm；
圖 2. 茚三酮顯色-白光
[樣品從左至右分別為：肌紅蛋白、
細(xì)胞色素 C、β-酪蛋白和牛血清蛋白 (BSA)]
再進(jìn)一步薄層展開，通過 HPTLC 二維分離，可以增加被分離物質(zhì)的數(shù)量。由下圖可知一維分離色譜可見 11 個分離條帶，二維分離色譜可見 17 個分離斑點。
圖 3. HPTLC 二維分離色譜圖: 細(xì)胞色素 C
表 1. HPTLC / DESI-MS 分析后獲得的細(xì)胞色素 C 的序列覆蓋率
序列覆蓋率因固定相涂層材料和分離質(zhì)量而異。應(yīng)用纖維素板的二維分離，序列覆蓋率幾乎與 HPLC / ESI-MS 檢測的序列覆蓋率相當(dāng)。
由此可見，HPTLC-MS 非常適合分析簡單和中等復(fù)雜的肽混合物。HPTLC / MS 聯(lián)用的一個特點是分離和檢測可以各自獨立進(jìn)行，因此基于薄層開放性色譜的特點可以靈活優(yōu)化分離和衍生化條件，使分離結(jié)果得到更多可能。同時薄層板均為一次性使用，可為各種條件優(yōu)化設(shè)計帶來極大的便利。
參考資料
[1] S. P. Pasilis et al. Anal. Bioanal. Chem. 391 (2008) 317
[2] S. P. Pasilis et al. J. Mass Spectrom. 43 (2008) 1627
從以上例子可見，高效薄層色譜法，憑著高效、快速、操作簡單、結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏度高和重現(xiàn)性好的優(yōu)勢，不單為樣品檢測帶來創(chuàng)新標(biāo)準(zhǔn)，加上近年來發(fā)展迅速，配合自動化與數(shù)字化技術(shù)，更能發(fā)揮爆發(fā)力，深受業(yè)界歡迎。
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