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CCK-8細胞實驗原理及步驟

來源:上海鹿森生物工程有限公司   2023年06月02日 17:16  

一、原理: CCK-8試劑盒用于快速靈敏地檢測細胞增殖和細胞毒性。工作原理為:在電子耦合試劑存在的情況下,WST-8(化學(xué)名:2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑單鈉鹽),可以被線粒體內(nèi)的脫氫酶還原生成高度水溶性的橙黃色的甲臜產(chǎn)物(formazan),其顏色的深淺與細胞增殖成正比,與細胞毒性成反比,對同樣的細胞,顏色的深淺和細胞數(shù)目呈線性關(guān)系。使用酶標儀在450nm波長處測定OD值,可以間接反映活細胞的數(shù)量。


二、用途:可用于細胞增殖測定、細胞毒性測定、腫瘤藥敏試驗等。


三、實驗步驟:

1.種板數(shù):根據(jù)你摸索的,或者查閱文獻確定你需要的種板濃度,根據(jù)種板濃度對細胞懸液進行稀釋,通常細胞增殖實驗每孔加入約1000-2000個細胞100ul,細胞毒性實驗每孔加入約5000~10000個細胞100ul(具體每孔所用的細胞的數(shù)目,需根據(jù)細胞的大小,細胞增殖速度的快慢等決定)。

2.種板:以96孔板為例,96孔板橫向是1-12的數(shù)字,縱向是A-H,可做多個實驗組,每組設(shè)置4-6個復(fù)孔,同時設(shè)置空白組,最邊緣孔加入PBS緩沖液減少蒸發(fā)帶來的影響,然后將細胞置于37℃ 5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12-24 h。

3.加藥及加藥后孵育時間:觀察細胞細胞貼壁良好,吸出各孔培養(yǎng)基,實驗組加入含不同濃度藥物的培養(yǎng)基,空白組加入不含藥物培養(yǎng)基,然后將96孔板在37℃ 5% CO2空氣的細胞培養(yǎng)箱中孵育適當時間,根據(jù)不同實驗細胞需求選擇適當?shù)姆跤龡l件和時間。

4.加入CCK-8:兩種方法,每孔直接加入10ul的CCK-8溶液,或者配置成含10%CCK-8溶液的培養(yǎng)基以換液的形式加入,注意加入過程中避免產(chǎn)生氣泡,可以將槍頭浸入培養(yǎng)液中緩慢加入。

5.加入CCK-8后孵育時間:將加完CCK-8的培養(yǎng)板放入37°C 5%CO2 培養(yǎng)箱中孵育1-4h,CCK-8試劑加入后孵育時間也需要自己摸索,隨著時間的增加,OD值就會增大??梢栽?.5h、1.0h、2.0h分別測OD值,把OD值控制在1.0左右。

6.測OD值:將96孔板取出,酶標儀檢測各孔在450nm波長處的OD值,分析處理數(shù)據(jù),繪制增殖曲線。

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