一、原理： CCK-8試劑盒用于快速靈敏地檢測(cè)細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性。工作原理為：在電子耦合試劑存在的情況下，WST-8（化學(xué)名：2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑單鈉鹽），可以被線粒體內(nèi)的脫氫酶還原生成高度水溶性的橙黃色的甲臜產(chǎn)物（formazan），其顏色的深淺與細(xì)胞增殖成正比，與細(xì)胞毒性成反比，對(duì)同樣的細(xì)胞，顏色的深淺和細(xì)胞數(shù)目呈線性關(guān)系。使用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值，可以間接反映活細(xì)胞的數(shù)量。

二、用途：可用于細(xì)胞增殖測(cè)定、細(xì)胞毒性測(cè)定、腫瘤藥敏試驗(yàn)等。

三、實(shí)驗(yàn)步驟：

1.種板數(shù)：根據(jù)你摸索的，或者查閱文獻(xiàn)確定你需要的種板濃度，根據(jù)種板濃度對(duì)細(xì)胞懸液進(jìn)行稀釋，通常細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)每孔加入約1000-2000個(gè)細(xì)胞100ul，細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)每孔加入約5000～10000個(gè)細(xì)胞100ul（具體每孔所用的細(xì)胞的數(shù)目，需根據(jù)細(xì)胞的大小，細(xì)胞增殖速度的快慢等決定）。

2.種板：以96孔板為例，96孔板橫向是1-12的數(shù)字，縱向是A-H，可做多個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每組設(shè)置4-6個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置空白組，最邊緣孔加入PBS緩沖液減少蒸發(fā)帶來(lái)的影響，然后將細(xì)胞置于37℃ 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12-24 h。

3.加藥及加藥后孵育時(shí)間：觀察細(xì)胞細(xì)胞貼壁良好，吸出各孔培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組加入含不同濃度藥物的培養(yǎng)基，空白組加入不含藥物培養(yǎng)基，然后將96孔板在37℃ 5% CO2空氣的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育適當(dāng)時(shí)間，根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)細(xì)胞需求選擇適當(dāng)?shù)姆跤龡l件和時(shí)間。

4.加入CCK-8：兩種方法，每孔直接加入10ul的CCK-8溶液,或者配置成含10%CCK-8溶液的培養(yǎng)基以換液的形式加入,注意加入過(guò)程中避免產(chǎn)生氣泡，可以將槍頭浸入培養(yǎng)液中緩慢加入。

5.加入CCK-8后孵育時(shí)間：將加完CCK-8的培養(yǎng)板放入37°C 5%CO2 培養(yǎng)箱中孵育1-4h，CCK-8試劑加入后孵育時(shí)間也需要自己摸索，隨著時(shí)間的增加，OD值就會(huì)增大。可以在0.5h、1.0h、2.0h分別測(cè)OD值，把OD值控制在1.0左右。

6.測(cè)OD值：將96孔板取出，酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔在450nm波長(zhǎng)處的OD值，分析處理數(shù)據(jù)，繪制增殖曲線。