質(zhì)粒的一般實(shí)驗(yàn)步驟

來源：上海一研生物科技有限公司 2023年06月13日 10:01

質(zhì)粒是使用廣泛的基因操作工具，可以進(jìn)行編碼基因、microRNA、lncRNA的功能研究、啟動(dòng)子活性、轉(zhuǎn)錄因子及3’UTR調(diào)控研究等。

實(shí)驗(yàn)步驟：

1)質(zhì)粒提取

1.10,0001min離心收集1.5-5ml菌液沉淀于1.5ml離心管中

2.加入100溶液1，振蕩至懸浮

3.加入200溶液2，立即輕柔顛側(cè)離心管6次，使菌體充分裂解，隨后將離心管冰上放置3分鐘

4.加入150山溶液3，立即溫和顛倒離心管數(shù)次，冰上放置3分鐘，10,00g離心10mins

5.將步驟4的上清轉(zhuǎn)移至新的離心管(盡量去除雜質(zhì))，加入等體積的苯酚/氖仿/異成醇混

合均勻10,000離心5min

6.將步驟5的上清轉(zhuǎn)移至新的離心管，加入2倍體積的無水乙醇，室溫放置5-1omin，沉

降DNA

7.10000g離心10分鐘，棄乙醇，保留沉淀，加入1ml706的乙醇洗滌沉淀，10,000離心5分鐘

8.倒掉乙醇溶液，用吸水紙吸凈管壁上的水珠，室溫蒸發(fā)痕量乙醇

9.加入適量含Rnase的TE或滅菌雙蒸水溶解質(zhì)粒DNA

2）質(zhì)粒鑒定瓊脂糖礙膠電泳

灌膠：膠中加入芡光染料< SYBR Green)

加樣：質(zhì)粒+上樣緩沖液→混勻

電泳

結(jié)果觀察：UV燈下

實(shí)驗(yàn)分析：

裂解細(xì)胞中除含有質(zhì)粒DNA外，還含有基因組DNA、各種RNA、蛋白質(zhì)和脂類等物質(zhì)，因

用堿裂解法除去雜質(zhì)

1、防止DNA裂解: Solution1

1)、所含糖增加溶洨黏度，維持滲透壓，防止DNA受機(jī)械剪切作用降解

2)、所含EDTA抑制酶活性

2、溶解與變性：Solution2

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