實(shí)驗(yàn)方法原理

當(dāng)重組病毒通過(guò)噬斑純化和擴(kuò)增后，免疫印跡可用于鑒定重組蛋白，并檢測(cè)其是否有預(yù)期的大小以及是否從感染細(xì)胞中分泌。下面的步驟是介紹檢測(cè)非分泌性（細(xì)胞內(nèi)）蛋白的，如果重組蛋白是分泌到培養(yǎng)基中的，可按注解中的步驟操作。

實(shí)驗(yàn)材料 生長(zhǎng)至匯片的單層 BS-C-1 細(xì)胞重組痘苗病毒儲(chǔ)液

試劑、試劑盒 wan全 MEM-5 培養(yǎng)基胰酶細(xì)胞裂解液5 × SDS 樣品緩沖液

儀器、耗材 6 孔組織培養(yǎng)板Sorvall 離心機(jī)95℃ 水浴鍋

實(shí)驗(yàn)步驟

1. 用生長(zhǎng)至匯片的單層 BS-C-1 細(xì)胞建立病毒感染細(xì)胞培養(yǎng)液（見(jiàn)基本方案 1 步驟 1~5）。

2. 用wan全 MEM-5 培養(yǎng)基將 5×105 細(xì)胞/孔放入 6 孔組織培養(yǎng)板培養(yǎng)（每孔終體積為 2 ml）。直至細(xì)胞匯片生長(zhǎng)（應(yīng)小于 24 h）。

3. 在使用前，將一定體積的痘苗病毒儲(chǔ)液與 0.25 mg/ml 胰酶混合，渦旋混勻。在 37℃ 水浴鍋中保溫 30 min，并在保溫過(guò)程中每隔 5~10 min 渦旋混勻一次。

病毒儲(chǔ)液的滴度常常在 2×109 pfu/ml 左右，但根據(jù)其來(lái)源的不同病毒滴度也可能低一些。

如果經(jīng)過(guò)渦旋混勻后，還可以看見(jiàn)團(tuán)狀物，將其冷卻到 0℃ 并在冰上超聲波作用 30 s?？梢灾貜?fù)幾次超聲，但超聲的間隔中應(yīng)當(dāng)使樣品在冰上冷卻。

4. 吸出培養(yǎng)基，加入 1 ml （終體積）MOI 為 10~30 pfu/細(xì)胞的wan全 MEM-5，培養(yǎng) 1~2 h，每隔大約 30 min 輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)板，使細(xì)胞均勻接觸病毒。

如果使用純化的病毒，應(yīng)在使用前在冰上超聲 30 s （見(jiàn)基本方案 1 步驟 7）。

如果分析的蛋白質(zhì)分泌到培養(yǎng)基中，要注意在感染和培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基中不應(yīng)添加血清或使用 1% 的血清，因?yàn)楦邼舛鹊难鍟?huì)干擾膠的分析。

5. 加入 2 ml 的wan全 MEM-5 培養(yǎng)基，培養(yǎng) 24~48 h。

6. 細(xì)胞刮刀輕輕刮下細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到離心管中，5~10℃，1800 g 離心 5 min，棄培養(yǎng)基。

對(duì)于分泌性蛋白質(zhì)，用 Centricon 10 microconcentrator （Amicon） 濃縮培養(yǎng)基，使體積縮小到原來(lái)的 1/5。此外，培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)也可以按下面的方法用三氯yi酸（TCA） 沉淀：

6.1 向樣品中加入 Triton X-100 至終濃度為 0.03% （V/V）；

6.2 加入等體積 20% TCA；

6.3 在冰上放置 15 min；

6.4 4℃，以最大轉(zhuǎn)速離心 15 min；

6.5 吸出上清，用 70% 乙醇洗沉淀；

6.6 空氣晾干沉淀，加入 5 μl 1 mol/L Tris 堿，溶于 1 × SDS 樣品緩沖液。

7. 用 200 μl 細(xì)胞裂解液重懸細(xì)胞沉淀，將其轉(zhuǎn)移至微量離心管中。渦旋混勻，在冰上放置 10 min。

8. 4℃，最大轉(zhuǎn)速離心 10 min。分離上清（細(xì)胞質(zhì)）和沉淀（細(xì)胞核）。

9. 在 20 μl 的上清中加入 5 μl 5 × SDS 上樣緩沖液，95℃ 加熱 5 min。將沉淀溶于 200 μl 的 1× SDS 樣品緩沖液，95℃ 加熱 5 min。

10. 按免疫印跡方法進(jìn)行操作。

注意事項(xiàng)

1. 所有培養(yǎng)都在加濕的 37℃ 5% CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，除非有特殊說(shuō)明。

2. 與活細(xì)胞接觸的器械和試劑都應(yīng)該是無(wú)菌的，操作也必須無(wú)菌。

3.細(xì)胞裂解液只含有非離子型去污劑，可能不能有效地抽提某些蛋白質(zhì)。在這種情況下，需要含有 SDS 的緩沖液。