原代細(xì)胞分離的方法有多種，常用的是機(jī)械解離細(xì)胞法、酶學(xué)解離細(xì)胞法以及螯合劑解離細(xì)胞法，下面我們就介紹酶解聚方法獲得純化的原代細(xì)胞。

1、胰蛋白酶 純化法

1）、在去除不需要的組織后，使用無(wú)菌的解剖刀和剪子把剩余的組織切成3~4 mm小片，通過(guò)懸浮在無(wú)鈣鎂的平衡鹽溶液中清洗組織碎片。讓組織碎片沉淀，去除上清液。重復(fù)清洗2到3次。

2）、將盛有組織碎片的容器置于冰上，去除殘留的上清液。加入0.25%溶解在無(wú)鈣鎂的平衡鹽溶液中的胰蛋白酶（100 mg組織加入1ml 胰蛋白酶）。

3）、在4℃孵育6到18小時(shí)，使幾乎沒(méi)有胰蛋白酶活性的酶盡可能滲透進(jìn)去。

4）、移棄組織碎片中的胰蛋白酶，在37℃孵育包含殘留胰蛋白酶的組織碎片20到30分鐘。

5）、在組織碎片加入熱的*培養(yǎng)基，用移液管輕輕地分散組織。如果使用無(wú)血清培養(yǎng)基，要加入大豆胰蛋白酶抑制劑。

6）、通過(guò)無(wú)菌不銹鋼絲網(wǎng)（100～200 mm）過(guò)濾，分散所有剩余組織。計(jì)數(shù)和接種細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)。

2、膠原酶純化法

1）、用無(wú)菌解剖刀和剪子把剩余組織切成3~4 mm小片，用Hanks'平衡液（HBSS）清洗組織碎片幾次。

2）、加入膠原酶（50～200單位/ml，溶解在HBSS中）。

3）、在37℃孵育4到18小時(shí)。加入3mM CaCl2增加解離效率。

4）、通過(guò)無(wú)菌不銹鋼絲網(wǎng)或尼龍網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞懸液，以分離分散細(xì)胞、組織碎片和較大的碎片。如果需要進(jìn)一步的解聚，在碎片中加入新鮮的膠原酶。

5）、通過(guò)離心在HBSS中清洗懸液幾次。

6）、再一次在培養(yǎng)基中懸浮細(xì)胞，計(jì)數(shù)和接種細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)。

3、Dispase純化法

1）用無(wú)菌解剖刀和剪子把剩余組織切成3~4 mm小片，用不含鈣鎂的平衡鹽溶液清洗組織碎片幾次。

2）、加入Dispase（0.6～2.4單位/ml 溶解在無(wú)鈣鎂的平衡鹽溶液）

3）、在37℃孵育20分鐘到幾個(gè)小時(shí)。

4）、通過(guò)無(wú)菌不銹鋼絲網(wǎng)或尼龍網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞懸液，以分離分散細(xì)胞、組織碎片和較大的碎片。如果需要進(jìn)一步的解聚，在碎片中加入新鮮的Dispase。

5）、通過(guò)離心在平衡鹽溶液中清洗懸液幾次。

6）、再一次在培養(yǎng)基中懸浮細(xì)胞，計(jì)數(shù)和接種細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)。

分離細(xì)胞后，首ci 傳代需要注意的問(wèn)題：

1）、傳代培養(yǎng)時(shí)先觀察細(xì)胞的活性。

2）、細(xì)胞的活率應(yīng)該超過(guò)90%，密度控制在80%左右

3）、對(duì)于無(wú)血清培養(yǎng)基，需要降低胰蛋白酶使用量。

（1）、 移棄使用過(guò)的細(xì)胞培養(yǎng)基。

（2）、使用不包含有鈣鎂的平衡鹽溶液或EDTA清洗細(xì)胞。在培養(yǎng)瓶背著細(xì)胞的一面加入清洗溶液，通過(guò)轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)瓶1到2分鐘清洗細(xì)胞層，然后去除清洗液。

（3）、加入胰酶消化，消化細(xì)胞與細(xì)胞，操作手法，試劑的效價(jià)有密切的關(guān)系，消化時(shí)應(yīng)注意觀察細(xì)胞形態(tài)，如細(xì)胞變得橢圓透亮，并且可以觀察到細(xì)胞與細(xì)胞間的間隙時(shí)，輕拍瓶身可以看見(jiàn)成流沙狀，即可中止消化，消化時(shí)盡量減少對(duì)細(xì)胞的吹打。

（4）、當(dāng)細(xì)胞*分離時(shí)，垂直放置培養(yǎng)瓶，讓細(xì)胞流到培養(yǎng)瓶的底部。在培養(yǎng)瓶中加入*培養(yǎng)基中止消化，計(jì)數(shù)并再次培養(yǎng)細(xì)胞。

（5）、對(duì)于無(wú)血清培養(yǎng)基，加入大豆胰蛋白酶抑制劑。通常使用1∶1（v∶v）0.25 mg/ml胰蛋白酶抑制劑到胰蛋白酶中將抑制胰蛋白酶活性。